国产女人喷潮视频在线观看,国产精品欧美成人片,91九色国产成人久久精品,成在线人免费无码高潮喷水,亚洲日韩成人无码不卡网站,久久久久国产一级毛片高清板,国产一二视频,丰满少妇av无码区,久久永久免费人妻精品我不卡 ,国产伦子系列沙发午睡

人類中超過30%的編碼蛋白質(zhì)的基因表達(dá)細(xì)胞外或細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。其中許多蛋白在各種病理生理?xiàng)l件下發(fā)揮著關(guān)鍵作用。近年來，靶向蛋白降解（TPD）技術(shù)已成為靶向傳統(tǒng)不可成藥蛋白的新型高效治療方式。然而，大多數(shù)TPD相關(guān)策略，包括PROTAC、分子膠和AUTAC等，只能降解胞質(zhì)蛋白或具有胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。在此，作者報(bào)道了iLYTACs，并通過一系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)了iLYTAC可以用于擴(kuò)展當(dāng)前LYTAC和相關(guān)技術(shù)的潛在應(yīng)用。下載化學(xué)加APP到你手機(jī)，更加方便，更多收獲。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

a

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

IGF2R結(jié)構(gòu)域11特異性結(jié)合IGF2。結(jié)合后，IGF2–IGF2R復(fù)合物經(jīng)歷細(xì)胞運(yùn)輸進(jìn)入溶酶體，最終導(dǎo)致IGF2降解。作者首先驗(yàn)證了IGF2的這種特殊性質(zhì)可以被用作一種有效的溶酶體靶向受體（LTR）配體，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外和膜蛋白的廣泛有效的溶酶體遞送和降解（圖1A、B和S1）。在概念驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，作者證實(shí)了細(xì)胞外生物素結(jié)合蛋白NeutrAvidin protein DyLight 650/488（NA650/NA488，圖1C和S2）的成功細(xì)胞攝取和溶酶體遞送。細(xì)胞的蛋白質(zhì)組裂解物的凝膠內(nèi)熒光掃描分析顯示，IGF2介導(dǎo)的NA488攝取與時(shí)間相關(guān)，顯著攝取在2小時(shí)開始發(fā)生，并持續(xù)24小時(shí)（圖S2C），且在洗出后2小時(shí)明顯觀察到NA488帶的熒光強(qiáng)度顯著降低，表明NA488的溶酶體降解成功。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，作者試圖將基于IGF2的iLYTAC建立為一個(gè)通用、方便和模塊化的平臺(tái)（圖1D）。I型iLYTACs是IGF2與POI結(jié)合物或納米體融合的產(chǎn)物，即IGF2-TB。II型iLYTAC（也稱為IGF2-Z）是免疫球蛋白G（IgG）的Z結(jié)構(gòu)域與IGF2融合，從而能夠融合大多數(shù)市售mAb（圖1E）。作者總共構(gòu)建了四種I型iLYTACs，即IGF2-Af_EGFR、IGF2-Af_Syn、IGF2-Nb_GFP和IGF2-Nb_PDL1。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

接下來，作者進(jìn)行了BLI實(shí)驗(yàn)，確證了iLYTACs中的IGF2仍保持對(duì)IGF2R的結(jié)合活性（圖2E和S7）。用LysoTracker Green對(duì)IGF2-TB處理的細(xì)胞進(jìn)行的進(jìn)一步共定位實(shí)驗(yàn)顯示，大多數(shù)內(nèi)化的IGF2-TB的溶酶體定位成功（圖2I和S8C）。作者在K562和HeLa細(xì)胞中用IGF2-Af_EGFR進(jìn)行了競爭攝取測定（圖S9A），進(jìn)一步驗(yàn)證了IGF2/IGF2R輔助攝取IGF2-TB。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

接下來，作者確證了iLYTACs能夠介導(dǎo)疾病相關(guān)的細(xì)胞外蛋白和膜蛋白的溶酶體降解（圖3A–D和S10A，B）。此外，添加了溶酶體抑制劑Baf和氯喹CQ后顯著抑制了EGFR降解，進(jìn)一步證實(shí)了溶酶體降解機(jī)制（圖3E）。作者進(jìn)一步評(píng)估了IGF2-Af_EGFR如何影響EGFR的下游信號(hào)傳導(dǎo)。急性EGF刺激（100 ng/mL，20分鐘）沒有降低EGFR水平，但顯著增強(qiáng)了磷酸化（圖3F，泳道2）。單獨(dú)用IGF2或Af_EGFR預(yù)處理沒有改變EGF刺激后EGFR的Y1068的磷酸化狀態(tài)（圖3F，泳道3和4）。然而，作者觀察到pEGFR表達(dá)在IGF2-Af_EGFR處理的細(xì)胞中顯著減少（圖3F，泳道5），這表明與西妥昔單抗（Cet）/Af_EGFR結(jié)合相比，IGF2-AfEGFR去除EGFR在抑制下游激酶信號(hào)傳導(dǎo)方面更有效。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證iLYTACs的普適性和靈活性，作者接下來設(shè)計(jì)并得到了靶向PD-L1的iLYTACs IGF2-Nb_PDL1和IGF2-3-Nb_PDL1。觀察到了與IGF2-Af_EGFR類似的效果（圖3G、H、S10D和S8D）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，作者進(jìn)一步評(píng)估了iLYTAC介導(dǎo)的細(xì)胞外蛋白降解。GFP和α-Syn被用作靶向蛋白；相應(yīng)的iLYTAC IGF2-Nb_GFP (圖 4A，4B）和IGF2-Af_Syn（圖4C，D）均對(duì)GFP和α-Syn表現(xiàn)出降解能力。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，為了探索在II型iLYTAC（或IGF2-Z）的基礎(chǔ)上開發(fā)通用降解平臺(tái)的可能性，作者使用類似于生產(chǎn)I型iLYTACs的方法將IGF2-Z在大腸桿菌中表達(dá)、純化并表征（圖5A和S3–S8）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

接下來，作者評(píng)估了IGF2-Z與Cet聯(lián)合是否可以降解內(nèi)源性EGFR（圖5E和S13A，B）；WB分析顯示，與Cet和IGF2-Z共同孵育的HeLa細(xì)胞內(nèi)的EGFR水平以劑量和時(shí)間依賴的方式顯著降低，在用摩爾比1:10 Cet/IGF2-Z 24小時(shí)孵育處理的細(xì)胞中觀察到有效的EGFR降解。IGF2和Z結(jié)構(gòu)域之間的連接體的長度不影響降解效率（圖S13C）。這種降解被溶酶體抑制劑抑制（圖5F）。免疫熒光和CLSM顯示，在用Cet+IGF2-Z處理的細(xì)胞中，膜結(jié)合的EGFR信號(hào)成功地輸送到主要的溶酶體（圖5G）。與用IGF2-Af_EGFR處理細(xì)胞的I型iLYTAC相比（圖3B–F），作者觀察到在EGF刺激后，用Cet+IGF2-Z處理的HeLa細(xì)胞中pEGFR和pAKT（S473；EGFR的下游靶標(biāo)）的水平更顯著地降低（圖5H）。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證IGF2-Z的普適性，作者研究了IGF2-Z降解CD20的能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用IGF2-Z+Ritu處理Raji細(xì)胞后，比單獨(dú)用Ritu或IGF2-Z處理的細(xì)胞的CD20水平低得多（圖5I和S13E）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，作者選擇IGF2-Z來評(píng)估其在小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布。靜脈注射Cy5標(biāo)記的IGF2-Z、Cet和Cy5（圖S14A）?；谔幚硇∈笪惭袩晒鈴?qiáng)度的清除率顯示，僅使用Cy5染料的清除率最快，其次是IGF2-Z，最后是Cet（圖6A），這與分子大小影響藥代動(dòng)力學(xué)的已知現(xiàn)象一致。主要器官的離體熒光成像也顯示出類似的清除趨勢（圖S14B–D）；IGF2-Z與Cet的復(fù)合物形成并沒有顯著影響IGF2-Z的清除率，這可能是由于血液中IgG水平高得多。此外，在IGF2-Z或Cet-5-h處理的小鼠中，觀察到肝臟的攝取最高。5小時(shí)時(shí)在腎臟中檢測到強(qiáng)烈信號(hào)，表明IGF2-Z正在迅速從血液循環(huán)中清除（圖6B和S14D）。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

隨后，作者使用HeLa細(xì)胞異種移植的Balb/c裸鼠，在體內(nèi)評(píng)估iLYTACs的治療潛力。結(jié)果表明，用IGF2-Z+Cet治療的小鼠的腫瘤體積和重量下降了～50%，而用IGF2-Af_EGFR治療的小鼠腫瘤體積和體重下降水平略低（圖6E和F）。WB結(jié)果也表明通過使用iLYTAC，體內(nèi)EGFR成功降解（圖6G/H）。