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黃酮是廣泛存在于植物中的一大類天然產(chǎn)物，如花青素、大豆異黃酮、水飛薊賓等，在功能性食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，黃酮資源依賴于植物中獲得，受制于植物種植周期長(zhǎng)、組分多含量低、分離純化工藝復(fù)雜等諸多弊端，產(chǎn)能小、成本高，嚴(yán)重限制了黃酮類產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)和市場(chǎng)拓展。利用合成生物技術(shù)設(shè)計(jì)構(gòu)建黃酮細(xì)胞工廠，推動(dòng)植物黃酮的微生物高效生產(chǎn)成為一種重要解決方案。由于物種差異，植物黃酮合成途徑在微生物中異源重構(gòu)面臨著適配性差、產(chǎn)量低等問題，距離商業(yè)化仍有較大差距。

　　近日，青島能源所呂雪峰團(tuán)隊(duì)在絲狀真菌中發(fā)現(xiàn)了黃酮生物合成基因簇（BGCs），通過合成途徑解析闡明了真菌黃酮合成新機(jī)制，豐富了對(duì)黃酮類化合物生物合成的認(rèn)識(shí)，同時(shí)為合成生物技術(shù)開發(fā)提供了新的選擇（圖1），相關(guān)研究成果在《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》（Angew. Chem. Int. Ed. 2023）期刊上發(fā)表。

　圖1. 真菌黃酮合成示意圖

　　利用自抗性基因共定位（SRGD）策略是開展天然產(chǎn)物基因組挖掘的一種有效方式，為了尋找具有抗菌和除草活性的天然產(chǎn)物，研究團(tuán)隊(duì)首先以合成支鏈氨基酸的關(guān)鍵酶乙酰乳酸合酶（ALS）為探針，在亮白曲霉中發(fā)現(xiàn)了負(fù)責(zé)合成黃酮類化合物氯黃酮的生物合成基因簇（圖2）?；钚栽u(píng)價(jià)顯示氯黃酮具有抑制擬南芥種子萌發(fā)和抑制病原菌生長(zhǎng)的活性，而體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)cfoL確實(shí)是編碼ALS的氯黃酮自抗性基因，因此具有開發(fā)成為除草劑和抗生素的潛力。

　　圖2. SRGD策略發(fā)現(xiàn)真菌氯黃酮合成基因簇及活性分析

　　植物黃酮的生物合成途徑目前已經(jīng)研究清楚，首先是查耳酮合酶（CHS）III型PKS以對(duì)羥基肉桂酰輔酶A為起始單元與3分子乙酰輔酶A縮合形成查耳酮；然后在查耳酮異構(gòu)酶（CHI）作用下形成黃烷酮，由黃酮合酶（FNS）進(jìn)一步催化黃烷酮形成黃酮骨架，最后在修飾酶的作用下形成多種多樣的黃酮類化合物。本研究中通過基因敲除、同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)亮白曲霉中查爾酮骨架由NRPS-PKS雜合酶CfoA以苯甲酸或?qū)αu基苯甲酸為起始單元與4分子乙酰輔酶A縮合形成，而非是植物的III型PKS裝配模式，說明真菌黃酮骨架合成機(jī)制與植物存在顯著差異。

　　圖3. 亮白曲霉氯黃酮生物合成途徑

　　在此基礎(chǔ)上，通過基因敲除和體外酶活實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CfoK催化查耳酮關(guān)環(huán)生成黃烷酮，這與植物中的CHI具有相同的功能。但是CfoK與目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CHI存在不同的進(jìn)化關(guān)系?；贏lphaFold2預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明CfoK通過His33介導(dǎo)的酸堿催化誘發(fā)查耳酮發(fā)生Oxa-Michael加成反應(yīng)，以6-endo-trig關(guān)環(huán)方式形成構(gòu)型專一的黃烷酮（圖4），這一機(jī)制不同于植物CHI中水介導(dǎo)的催化過程，因此CfoK是一種新穎的真菌查耳酮異構(gòu)酶。 

　　圖4. 真菌中查耳酮異構(gòu)酶CfoK的表征

　　亮白曲霉中由黃素依賴型氧化還原酶CfoJ行使黃酮合酶（FNS）功能，將黃烷酮轉(zhuǎn)化為黃酮，進(jìn)化樹分析顯示其與已知的FNS I （2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶）和FNS II（細(xì)胞色素氧化酶P450）處于不同的分支。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CfoJ是通過典型的黃素依賴型氧化還原酶催化機(jī)制介導(dǎo)C2-C3位的脫氫，將黃烷酮轉(zhuǎn)化為黃酮，這與植物FNS的自由基催化機(jī)制完全不同，因此CfoJ是一種新型的真菌黃酮合酶（圖5）。

　　圖5. 真菌中黃酮合酶CfoJ的表征

　　該研究完整解析了真菌黃酮獨(dú)特的生物合成途徑，提示真菌黃酮合成途徑在進(jìn)化上是獨(dú)立的，而非通過基因水平轉(zhuǎn)移從植物中獲得。這一發(fā)現(xiàn)豐富了自然界黃酮生物合成的多樣性，同時(shí)也為其合成生物技術(shù)開發(fā)與微生物高效制造提供了新思路，因此對(duì)黃酮的應(yīng)用價(jià)值開發(fā)具有重要意義。

　　微生物制造工程中心呂雪峰研究員和黃雪年研究員為本論文的共同通訊作者，博士研究生張偉為論文的第一作者，能源作物分子育種團(tuán)隊(duì)付春祥研究員和吳振映副研究員參與了此項(xiàng)工作。本研究獲得了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、山東省人才計(jì)劃及山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的支持。（文/圖 張偉 黃雪年）

　　原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202215529

　　Wei Zhang, Xuan Zhang, Dandan Feng, Yajing Liang, Zhenying Wu, Siyu Du, Yu Zhou, Ce Geng, Ping Men, Chunxiang Fu, Xuenian Huang*, Xuefeng Lu*. Discovery of a Unique Flavonoid Biosynthesis Mechanism in Fungi by Genome Mining. Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202215529.