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目標(biāo)導(dǎo)向合成（TGS）是一種無需事先合成和高通量篩選即可識別目標(biāo)選擇性先導(dǎo)物的強(qiáng)大工具。它已被有效地用于各種治療性蛋白和核糖核蛋白靶點(diǎn)的抑制劑的簡單合成。然而，作為模板的DNA/RNA靶點(diǎn)在設(shè)計和開發(fā)用于調(diào)節(jié)基因功能的小分子方面的研究仍然較少。

由于肽和擬肽大環(huán)的結(jié)構(gòu)限制，它們表現(xiàn)出代謝穩(wěn)定性和增強(qiáng)的生物分子靶標(biāo)結(jié)合親和力仿肽大環(huán)的大表面積阻止了與雙鏈DNA的插層結(jié)合，并顯示了對DNA四鏈的選擇性。疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)已被用作構(gòu)建大環(huán)骨架的工具，在肽和碳水化合物化學(xué)、超分子系統(tǒng)和藥物化學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。雙官能團(tuán)片段之間的雙環(huán)加成進(jìn)行大環(huán)化需要很高的稀釋條件。通過原位雙擊反應(yīng)合成靶標(biāo)導(dǎo)向的多肽，如大環(huán)配體，不僅能有效構(gòu)建大環(huán)結(jié)構(gòu)，還有助于識別生物靶標(biāo)的結(jié)合劑。然而，從反應(yīng)混合物中識別原位生成的配體一直具有挑戰(zhàn)性。在這項(xiàng)工作中，作者團(tuán)隊(duì)提出了G4s可以選擇性地導(dǎo)向雙炔和雙疊氮片段合成一個大環(huán)類肽的方案（Scheme 1）。這種大環(huán)配體也已在活細(xì)胞中由其相應(yīng)片段合成，顯示出很有前景的生物學(xué)特性。

Scheme 1. DNA功能化磁性金納米顆粒靶向?qū)蚝铣蒅4選擇性配體的示意圖（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了生成目標(biāo)特異性配體，作者制備了6個雙炔（1a-f）和9個單/雙疊氮（2a-i），其中包含脂肪族、芳香族和羧酰胺官能團(tuán)以及烷基胺側(cè)鏈（Fig. 1a-b）。以c-MYC、h-TELO、c-KIT1、c-KIT2、BCL2 G4 DNA和一個dsDNA作為DNA模板，在鍍金磁性納米顆粒（AuMNPs）上進(jìn)行瞬間共價系鏈（Scheme 1）。UV-Vis光譜證實(shí)了DNA與納米顆粒的結(jié)合（Fig. 1）。CD光譜顯示，固定在Au-MNPs上的c-MYC, c-KIT1, c-KIT2, BCL2和h-TELO G4s具有典型的CD特征，并保持其G4構(gòu)象。在反應(yīng)性方面，c-MYC G4-AuMNPs生成雙三唑基大環(huán)配體M1，h-TELO G4-AuMNPs也得到了相同的產(chǎn)物（Fig. 1c-d），并且前者具有更高的相對產(chǎn)率。

Fig 1. G4納米模板定向原位環(huán)加成（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

為了確定原位生成M1的區(qū)域選擇性，作者在高稀釋條件下用標(biāo)準(zhǔn)Cu(I)-催化疊氮炔環(huán)加成（CuAAC）合成了M1（Fig. 2a）。觀察到原位反應(yīng)和Cu(I)-催化反應(yīng)都產(chǎn)生1,4-雙取代的抗三唑區(qū)域異構(gòu)體。

為了了解這類大環(huán)的結(jié)合特性，作者團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步通過Cu(I)-催化CuAAC合成了3個結(jié)構(gòu)相似的化合物M2、M3和M4（Fig. 2a-b）。G4定向合成沒有檢測到1b和2b組分形成的大環(huán)M4。含雙疊氮化合物（2a，2b）的吡啶雙羧基酰胺（1a，1b）與含雙炔化合物的吡啶雙羧基酰胺（1a，1b）的反應(yīng)，得到高收率（70-78%）的雙三唑大環(huán)M1-M4（Fig. 2a-b）。這類大環(huán)包含4個酰胺鍵和2個酰胺鍵同構(gòu)體（三唑結(jié)構(gòu)單元），可作為細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)的潛在治療性擬肽配體。

Fig 2. Cu(I)-催化疊氮炔環(huán)加成反應(yīng)合成M1-M4大環(huán)化合物及其結(jié)構(gòu)和分子對接（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

M4的結(jié)構(gòu)通過單晶X-射線分析確認(rèn)（Fig. 2c），由于這些大環(huán)（M1-M4）的大環(huán)核具有精確的幾何互補(bǔ)和較大的表面積，預(yù)計它們對G4 DNA具有選擇性。此外，用熒光滴定法測定配體對不同G4的結(jié)合親和力（Kd）。觀察結(jié)果表明，盡管兩種配體都與h-TELO結(jié)合，但它們對c-MYC的結(jié)合親和力相對較高（Fig. 3c）。與M1和M2相比，具有相似循環(huán)核的配體M3和M4對c-MYC沒有太大的特異性和親和力。與未生成M4的TGS結(jié)果一致，M4對c-MYC、c-KIT2和h-TELO G4s表現(xiàn)出非特異性和弱結(jié)合。這一趨勢表明，帶有側(cè)鏈的大環(huán)配體M1和M2對G4s的結(jié)合親和力高于沒有側(cè)鏈的M3（疊氮基吡啶環(huán)側(cè)鏈）和M4。熒光和ITC研究表明，這些配體與雙鏈DNA的結(jié)合微不足道。分子模型研究進(jìn)一步表明，配體M1在c-MYC G4的存在下獲得了平坦但靈活的構(gòu)象（Fig. 2e），盡管從晶體結(jié)構(gòu)上觀察到大環(huán)核是非平面的。CD光譜研究顯示，即使存在15摩爾當(dāng)量的大環(huán)（M1-M4），c-MYC G4也能保持其構(gòu)象。

Fig 3. 配體的RET-melting、Tm和ITC分析（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接下來，XTT法檢測的細(xì)胞毒性結(jié)果表明，配體M1、M2、M3和M4對HeLa細(xì)胞具有相似的細(xì)胞毒性，但對正常NKE細(xì)胞的毒性均較低（IC50 ? 60 μΜ）。流式細(xì)胞術(shù)使用凋亡標(biāo)記（Annexin V和PI）分析顯示，M1誘導(dǎo)61%的細(xì)胞群凋亡，10.8%的細(xì)胞群壞死。M2還誘導(dǎo)45%的細(xì)胞群凋亡，8.7%的細(xì)胞群壞死。

Fig 4. 配體分子的qRT-PCR、Western blot、雙熒光素酶測定和免疫細(xì)胞化學(xué)分析（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

通過qRT-PCR和Western Blot研究配體對HeLa細(xì)胞中相對于管家基因表達(dá)的c-MYC基因表達(dá)的體外影響（Fig. 4a-c），結(jié)果表明M1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上比M2更有效地抑制c-MYC的表達(dá)，而不改變管家基因的表達(dá)。雙熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)M1和M2分別降低了c-MYC啟動子連接的熒光素酶表達(dá)51%和40%（Fig. 4d）。然而，M1和M2都沒有改變c-MYC突變啟動子中的熒光素酶表達(dá)（不能形成G4結(jié)構(gòu)），這表明觀察到的c-MYC表達(dá)下調(diào)是由四聯(lián)體穩(wěn)定引發(fā)的。

接下來，作者通過疊氮和炔的無銅點(diǎn)擊反應(yīng)來探索其在細(xì)胞中的可行性。對Hela細(xì)胞提取物進(jìn)行ESI-MS分析，發(fā)現(xiàn)M/z值與M1對應(yīng)，表明細(xì)胞大環(huán)化。用1a和2a處理的細(xì)胞也增加了約2倍的BG4焦點(diǎn)，這表明細(xì)胞內(nèi)形成的M1隨后穩(wěn)定并捕獲內(nèi)源性G四聚體結(jié)構(gòu)。