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光動力療法（PDT）已成為一種很有前途的抗癌方法，與傳統(tǒng)的癌癥治療方式相比，PDT具有相對無創(chuàng)性，而且由于其獨特的光生物學機制，可以重復應(yīng)用，沒有耐藥問題。為了增強腫瘤的定位，光敏劑通常與腫瘤靶向配體結(jié)合，如抗體、多肽、適配體和葉酸。雖然這種主動靶向方法可以使光敏劑靶向傳遞，但正常細胞意外攝取這些偶聯(lián)物仍然是不可避免的，因為大多數(shù)癌癥相關(guān)受體并不只在癌細胞中表達。此外，一些靶受體的緩慢轉(zhuǎn)運很容易導致飽和，限制了受體介導的偶聯(lián)物的內(nèi)吞作用。

為了規(guī)避這些問題，雙受體靶向策略已被探索，以促進光敏藥物的靶向傳遞。由于癌細胞經(jīng)常過表達不止一個表面受體，這種雙受體靶向策略可以增加配體-受體相互作用的概率，與單一受體靶向方法相比，這增強了癌細胞的攝取和更精確的靶向。然而，在目前的設(shè)計中，兩個靶向配體通常被合并在一個單一的實體中，這就導致生物偶聯(lián)物仍然可以內(nèi)化到只有兩種受體中的一種的細胞中，從而降低了對特定類型癌細胞的特異性。此外，由于這些生物偶聯(lián)物大多數(shù)是““always-on”的熒光團，因此不可避免地會有顯著的熒光背景信號。為了降低背景信號的干擾，生物正交開啟探針得到了積極的探索。生物正交探針在與相應(yīng)的化合物進行生物正交偶聯(lián)后，可以恢復熒光發(fā)射，從而產(chǎn)生更高的信噪比。雖然這種方法已被用于生物成像，但使用生物正交化學來激活PDT的報道很少。鑒于此，Dennis K. P. Ng教授課題組基于前期工作設(shè)計的生物正交激活四嗪取代BODIPY光敏劑和高效的逆電子需求的Diels-Alder（IEDDA）反應(yīng)，提出了一種雙受體介導的生物正交激活策略，以增強光動力作用的腫瘤特異性，降低對正常組織的毒副作用（圖1）。

圖 1. 雙受體介導的生物正交激活光敏劑的設(shè)計示意圖（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

在該設(shè)計策略中，四嗪取代的BODIPY染料用作光敏劑，其中四嗪取代基既抑制了染料的發(fā)光和光敏活性，同時也是進行生物正交反應(yīng)的單元。為了實現(xiàn)主動靶向，作者將廣泛使用的腫瘤靶向生物素配體引入到BODIPY上，從而得到了一種生物素受體靶向和可激活的雙功能光敏劑化合物1。對于另一種生物正交成分化合物2，BCN與線性肽CMYIEALDRYAC的環(huán)狀形式偶聯(lián)，該肽被發(fā)現(xiàn)對EGFR過表達的癌細胞具有很強的結(jié)合親和力。為了研究親二烯試劑對1活化的影響，作者將2的BCN-CH₂基團替換為TCO部分得到化合物3進行比較。首先，為了確定BCN或TCO偶聯(lián)物對1的生物正交激活效果，作者研究了1與非肽偶聯(lián)的BCN-CH₂OH和TCO-OH的IEDDA反應(yīng)（圖2）。結(jié)果表明，與TCO相比，BCN可以在IEDDA反應(yīng)后容易地生成具有明確立體化學性質(zhì)的高熒光噠嗪產(chǎn)物。因此，BCN衍生物2表現(xiàn)為更好的親二烯試劑，并被選擇用于后續(xù)研究。

圖 2. 化合物1與TCO-OH（或3）和BCN-CH2OH（或2）的IEDDA反應(yīng)（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接著，作者研究了化合物1的光物理性質(zhì)（圖3）?；衔?/span>1在539 nm處有較強的吸收帶，當激發(fā)波長為510 nm時，在556 nm處可以觀察到微弱的熒光，熒光量子產(chǎn)率為0.003。這種弱熒光發(fā)射可以歸因于兩個碘原子引起的重原子效應(yīng)和四嗪基團的淬滅效應(yīng)。而當加入化合物2后，雖然吸收光譜沒有明顯變化，但熒光強度大大增強，熒光量子產(chǎn)率為0.028。該熒光的增強是由四嗪部分轉(zhuǎn)化為噠嗪所引起的淬滅途徑的弛豫引起的。然后，作者進一步研究了化合物2激活1光動力治療效果的能力。當加入化合物2后，單線態(tài)氧產(chǎn)生的效率從0.20顯著提高到0.71，從而證明了生物正交激活PDT的可行性。

圖 3. 化合物1的光物理性質(zhì)（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

基于良好的光學實驗結(jié)果，作者接下來在細胞水平上研究了1與2偶聯(lián)時的靶向和激活效應(yīng)（圖4）。作者選擇了四種不同的細胞系包括A549細胞（同時表達生物素受體和EGFR），HeLa細胞（只表達生物素受體），HCT116細胞（只表達EGFR）和HEK293細胞（兩種受體都不表達）。首先，作者確定了孵育時間，將上述細胞系的細胞與1孵育1 h，然后在有或不存在2的培養(yǎng)基中孵育6 h。結(jié)果顯示，僅與1孵育后，由于四嗪部分的強淬滅效應(yīng)，所有四種細胞系均觀察到微弱的熒光。然而，在與2孵育后，A549細胞觀察到強烈的細胞內(nèi)熒光，其強度增加了約5倍。對于其它三種細胞系，熒光信號仍然相對較弱。為了進一步證明活化的特異性，作者在體外研究中使用了2的非肽偶聯(lián)類似物，即BCN-CH₂OH作為對照化合物。由于缺乏EGFR靶向環(huán)肽，BCN-CH₂OH能夠以非選擇性的方式進入所有細胞，結(jié)果A549和HeLa細胞的熒光強度大約是其它兩種細胞系的2倍。同樣地，作者應(yīng)用非生物素化的BODIPY 4進行了對照，從而證明了雙受體介導的生物正交激活策略的特異性。并且實驗結(jié)果表明這兩種生物正交組分可以很好地靶向到溶酶體。

圖 4. 細胞成像實驗（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

此外，化合物1在細胞內(nèi)被2激活的ROS生成能力也被證明（圖5）。而且，通過細胞毒性實驗驗證了這種雙受體靶向策略可以實現(xiàn)特異性靶向治療，僅在A549細胞中顯示出優(yōu)異的光動力治療效果。

圖 5. 細胞光動力治療實驗（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）