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JACS：精氨酸ADP-核糖基化：翻譯后修飾泛素蛋白的化學(xué)合成
來(lái)源：化學(xué)加原創(chuàng) 2022-11-20
導(dǎo)讀：近日，荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Dmitri V. Filippov和Gerbrand J. van der Heden van Noort團(tuán)隊(duì)在JACS上發(fā)表了題為“Arginine ADP-Ribosylation: Chemical Synthesis of Post-Translationally Modified Ubiquitin Proteins”的文章，開(kāi)發(fā)和優(yōu)化了用腺苷-二磷酸-核糖基（ADPr）基團(tuán)制備在精氨酸殘基上修飾的肽和蛋白質(zhì)的方法。該方法包括將含有多肽的鳥氨酸與α-連接的異硫脲N-核糖苷反應(yīng)，隨后在核糖基部分的5′-羥基處安裝磷酸單酯，然后轉(zhuǎn)化為二磷酸腺苷。作者使用這種方法獲得四種ADP-核糖基化泛素（UbADPr）的區(qū)域異構(gòu)體，實(shí)現(xiàn)了在泛素（Ub）蛋白內(nèi)不同精氨酸位置上的ADP-核糖基殘基修飾，是作為完全合成精氨酸連接ADPr修飾蛋白的首例報(bào)道。
細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯后修飾（PTM）會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能、定位和廣泛的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。PTM包括相對(duì)較小的基團(tuán)，如磷酸鹽或甲基，但也可能涉及更復(fù)雜的分子實(shí)體，如（多）糖苷和ADP-核糖（ADPr）部分，甚至整個(gè)蛋白質(zhì)，如泛素（Ub）。在ADPr的情況下，單ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶（mARTs）通過(guò)靶蛋白中的親核氨基酸側(cè)鏈催化煙酰胺從β-NAD中置換，從而通過(guò)α-構(gòu)型的核糖鍵有效地將ADP-核糖連接到蛋白質(zhì)。與大多數(shù)PTM一樣，ADP-核糖基化是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過(guò)程，特異性寫入器（mART）和橡皮擦（ADPr-水解酶（ARH））酶可以作用于特定的蛋白質(zhì)或氨基酸。精氨酸殘基的δ-胍基團(tuán)的ADP-核糖基化通常由ART-C亞家族催化。軍團(tuán)菌使用SidE蛋白（SdeA、SdeB、SdeC和SidE）劫持真核宿主細(xì)胞的泛素途徑，并以非常規(guī)的方式泛素化宿主細(xì)胞蛋白。這種多步驟級(jí)聯(lián)從軍團(tuán)菌SidE mART結(jié)構(gòu)域開(kāi)始。隨后，SidE中的磷酸二酯酶（PDE）結(jié)構(gòu)域催化宿主細(xì)胞底物蛋白的絲氨酸與精氨酸連接的Ub之間形成磷酸二酯鍵ADPr同時(shí)排出一磷酸腺苷（Fig. 1B）。通過(guò)這種方式，細(xì)菌效應(yīng)酶通過(guò)精氨酸-磷酸核糖鍵有效地將宿主Ub連接到宿主底物蛋白。Fig. 1: （A）本研究提出的進(jìn)展和（B）嗜肺乳桿菌酶用于（去）泛素化宿主細(xì)胞底物蛋白的途徑的示意。（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）作者團(tuán)隊(duì)和其他人之前已經(jīng)報(bào)道了ADP-核糖基化肽的合成，其中ADP-核糖連接到Ser、Thr或Cys、和Asn、Gln以及非天然氨基酸（Fig. 1A）。本文中，作者開(kāi)發(fā)了一種普遍適用于在精氨酸上合成ADP核糖基化肽的方法，并將這種策略擴(kuò)展到天然連接的ADP-核糖基化蛋白UbADPr的全化學(xué)合成。首先，作者進(jìn)行了異硫脲核糖苷的合成。該化合物的合成始于5-O-((tert-butyl)-diphenylsilyl)-β-d-ribofuranosyl azide 2（Scheme 1A）。經(jīng)過(guò)嘗試，在硅藻土墊上過(guò)濾除去催化劑后，無(wú)需進(jìn)一步處理或純化所得濾液即連接異硫氰酸酯。最后，分別以64%和12%的產(chǎn)率獲得核糖基異硫脲1α和1β。Scheme 1. 精氨酸連接的ADPr肽的合成方案。（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）得到核糖基異硫脲1α之后，作者在樹脂上進(jìn)行了模型七肽14（Ac-GRADPrLIFAG-OH）的合成（B）。肽14來(lái)源于人Ub蛋白，含有已知在Arg42殘基上被嗜肺乳桿菌效應(yīng)酶ADP核糖基化的氨基酸。Nδ-Alloc保護(hù)的鳥氨酸被摻入肽序列中ADP-核糖基化位點(diǎn)上。經(jīng)過(guò)Alloc保護(hù)和脫保護(hù)，使用AgNO3作為路易斯酸將構(gòu)建單元1α對(duì)肽6進(jìn)行胍基化修飾。LC-MS分析顯示完全轉(zhuǎn)化。接下來(lái)，對(duì)核糖基部分上的5′-OH進(jìn)行脫硅烷、對(duì)伯醇進(jìn)行磷化和PIII到PV氧化。對(duì)肽11的脫保護(hù)制備了用于PV到PIII與以TBS和Boc為保護(hù)基團(tuán)的腺苷酰胺12偶聯(lián)。隨后，用DBU去除焦磷酸部分上的氰乙基保護(hù)基團(tuán)，得到受保護(hù)的肽-ADPr 13。最后，在DCM中使用10%三氟乙酸（TFA）從樹脂中裂解肽，經(jīng)RP-HPLC純化分離出肽14（總產(chǎn)率為9.3%），這是首個(gè)合成Arg連接的ADPr肽的例子。同時(shí)，盡管用于胍基化反應(yīng)的異硫脲核糖是純?chǔ)?構(gòu)型，作者通過(guò)1H NMR觀察到異構(gòu)體的混合物比例為6：4（α / β）。接下來(lái)，作者的合成方法從肽推斷到蛋白質(zhì)?；瘜W(xué)合成Arg42UbADPr使用類似于獲得肽14的方案進(jìn)行，并通過(guò)小樹脂樣品的測(cè)試裂解進(jìn)行監(jiān)測(cè)。首先，經(jīng)過(guò)脫保護(hù)暴露鳥氨酸部分的胺，與1α的樹脂上胍基化反應(yīng)順利進(jìn)行。隨后的磷酸化、氧化和PV–PIII偶聯(lián)產(chǎn)生完全保護(hù)的樹脂結(jié)合Arg42UbADPr。作者通過(guò)孵育UbADPr證實(shí)了這種酸在TFA（90.5%）中1.5小時(shí)的穩(wěn)定性（和庚聚體14）。使用這些條件，從樹脂中完全裂解和整體脫保護(hù)，然后進(jìn)行HPLC純化，得到合成的Arg42UbADPr18的總收率為1.8%。通過(guò)在SPPS期間將Nδ-Alloc保護(hù)的鳥氨酸結(jié)合在蛋白質(zhì)的另一位置，可以直接將ADPr基團(tuán)引入到Ub中的其它精氨酸殘基。作者成功地在Ub的Arg54、Arg72或Arg74上引入了UbADPr，獲得共軛物19–21，總分離產(chǎn)率分別為1.8%、1.2%和1.7%。為了研究軍團(tuán)菌效應(yīng)酶（DUPs）是否能夠水解所合成的ADPr肽中的焦磷酸鹽，作者將Ub衍生的Arg-ADPr七肽14與DupA孵育，并使用1H NMR進(jìn)行了表征。結(jié)果證實(shí)了合成的Arg-ADPr肽被酶的催化活性識(shí)別和加工。此外，DupA似乎更喜歡α而不是β，水解α-構(gòu)型的Arg-ADPr肽14（大約1.5 ×）比其β-異構(gòu)體更快。這也與之前的報(bào)道相一致。受到DupA處理合成ADPr肽這一事實(shí)的鼓舞，作者接下來(lái)著手比較水解速率與酶促產(chǎn)生Arg42UbADPr的水解速率。將合成的ADPr肽在緩沖溶液中在DupA存在下進(jìn)行孵育，并在指定時(shí)間使用高分辨率質(zhì)譜分析（Fig. 2C）。在該水解測(cè)定中，酶Arg42UbADPr在30分鐘內(nèi)被DupA完全水解至Arg42UbPr。泛素衍生的庚聚體14和15的速率低于Arg42UbADPr，90分鐘后分別顯示48%和52%的水解。接下來(lái)，作者通過(guò)DupA孵育各自的UbADPr類似物，研究了所合成的4個(gè)UbADPr蛋白18?21的識(shí)別和水解情況，并與酶制備的Arg42UbADPr進(jìn)行了比較。Arg42UbADPr在沒(méi)有DupA的緩沖液中，長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)不會(huì)導(dǎo)致水解。合成的Arg42UbADPr18和Arg42衍生的UbADPr庚聚體14幾乎完全加工，酶Arg42UbADPr也是如此。盡管Arg74UbADPr低于Arg42UbADPr，但Arg74UbADPr的水解程度明顯高于Arg54UbADPr和Arg72UbADPr。執(zhí)行類似的測(cè)定并分析較早時(shí)間點(diǎn)（15-90分鐘）的轉(zhuǎn)換顯示酶Arg42UbADPr15分鐘后完全水解。Arg42UbADPr在這段時(shí)間內(nèi)水解不太明顯（30分鐘后為52%）和（90分鐘后為65%）（Fig. 3B），而其它三個(gè)UbADPr通過(guò)Arg72，Arg74和Arg54連接的DupA水解明顯較少，佐證了DupA對(duì)Arg42的偏好。Arg42UbADPr可能是以與酶Arg42UbADPr相當(dāng)?shù)乃俣忍幚恙?異構(gòu)體。Fig.3. DupA介導(dǎo)的UbADPr水解成UbPr。（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）作者的下一個(gè)目標(biāo)是研究軍團(tuán)病發(fā)病的關(guān)鍵生物過(guò)程SdeA介導(dǎo)的底物ER蛋白與Ub ADPr的連接。作者合成了一種20聚體肽，來(lái)源于已知是SidE效應(yīng)子底物的ER重塑RTN4b蛋白（23），在N-末端連接羅丹明熒光團(tuán)。正如已經(jīng)報(bào)道的那樣，SdeA偶連Arg42UbADPr到肽23形成磷酸核糖連接Arg42Ub-RTN4b產(chǎn)物（Fig. 4A）并顯示焦磷酸鍵的部分水解至Arg42UbPr。這證實(shí)了肽23是誘導(dǎo)PDE介導(dǎo)的連接Arg42UbADPr的合適底物，并且四種合成泛素18-21也可以參與這一過(guò)程。Fig.4. SdeA介導(dǎo)的UbADPr連接熒光RTN4b 20-聚體片段23。（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心Dmitri V. Filippov和Gerbrand J. van der Heden van Noort團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了在精氨酸連接ADPr肽和蛋白質(zhì)UbADPr的方法，是攜帶天然精氨酸鍵的ADP核糖基化蛋白質(zhì)的首次全化學(xué)合成。ADPr肽和ADPr泛素區(qū)域異構(gòu)體在水解和連接測(cè)定中能夠被軍團(tuán)菌效應(yīng)子（DupA和SdeA）識(shí)別。在精氨酸殘基上進(jìn)行定點(diǎn)引入ADPr的能力可以獲得生化方法無(wú)法的得到的明確定義材料，并且在水解測(cè)定中，軍團(tuán)菌效應(yīng)子DupA和SdeA有利于Arg42UbADPr聯(lián)動(dòng)。毫無(wú)疑問(wèn)，該方法為肽和蛋白質(zhì)提供天然ADPr氨基酸連接，用于分析參與安裝和去除ADPr修飾的酶的位點(diǎn)特異性。
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