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蛋白質(zhì)的位點選擇性功能化標記在化學(xué)生物學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用。通過化學(xué)或酶促反應(yīng)對蛋白質(zhì)進行位點選擇性修飾對于包括細胞和體內(nèi)成像、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物釋放和材料科學(xué)在內(nèi)的各個領(lǐng)域都很重要。天然存在的酶經(jīng)過工程改造，可以接受N-端、C-端和內(nèi)部標記具有適當氨基酸識別序列的蛋白質(zhì)的新底物。這些方法對于特定位點標記蛋白質(zhì)具有革命性意義，但底物特異性、反應(yīng)動力學(xué)甚至試劑穩(wěn)定性的差異可能導(dǎo)致標記不完全以及標記和未標記蛋白質(zhì)不可分離的混合。使用遺傳編碼的親和標簽純化復(fù)雜混合物（例如裂解物或酶催化標記反應(yīng)）僅限于從混合物中去除單個蛋白質(zhì)種類。用小分子親和手柄標記的蛋白質(zhì)也可以通過親和層析選擇性純化。而生物正交化學(xué)也已用于將親和標簽共價連接到蛋白質(zhì)或在樹脂上共價捕獲蛋白質(zhì)，這種方法將生物正交基團應(yīng)用在蛋白質(zhì)純化而不是功能分子與蛋白質(zhì)靶標的結(jié)合。廣泛的位點選擇性蛋白質(zhì)偶聯(lián)方法可以受益于小分子、雙重用途標簽，其中單個官能團既可以促進蛋白質(zhì)純化，又可以作為后續(xù)快速和定量生物正交標記。

為此，作者開發(fā)了具有雙重作用的親和生物正交化學(xué)標簽（ABC-tags），即促進蛋白質(zhì)純化以及作為后續(xù)快速和定量生物正交標記的手柄（Fig. 1A）。作者設(shè)計了3-甲基-6-(2-吡啶基)四嗪的衍生物，可用于螯合固定化金屬離子親和層析（IMAC）-通常用于蛋白質(zhì)純化的樹脂（Fig. 1B）。這些小型的兩用標簽可作為工具，與C-端、N-端或內(nèi)部殘基的位點選擇性蛋白偶聯(lián)方法結(jié)合使用。由于四嗪連接的二氫噠嗪產(chǎn)物還保持對亞氨基乙酸鎳（Ni-IDA）樹脂的親和力，因此可以在“樹脂上”進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)綴合反應(yīng)，以提供二聚體和異三聚體蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，而無需額外的純化步驟。

Fig. 1: (A)用于Ni(IDA)純化標記蛋白和生物正交反應(yīng)的ABC標記(B)與Ni(IDA)樹脂螯合的吡啶基四嗪標記蛋白(PDB_ID 3KZY)（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

首先，作者設(shè)計并評估了一系列潛在的ABC標標簽在連接到模型蛋白時與Ni-IDA瓊脂糖樹脂結(jié)合的能力（Fig. 2）。通過ESI-MS確認綠色熒光蛋白（GFP）用每個標簽進行位點特異性標記，并通過紫外-可見光譜測定總結(jié)合蛋白（Fig. 2）。初步研究結(jié)果表明吡啶基取代基的重要性（Fig. 2）。附加雙吡啶基-Tz標簽(1g)將結(jié)合能力提高到9 mg/mL，相對于1d增加了2.6倍，這表明使用多價吡啶基-Tz附件的方法可用于提高結(jié)合能力。

Fig. 2: GFP（PDB_ID 2B3P）用一組四嗪化合物在半胱氨酸處進行了位點特異性修飾并評估了與Ni(IDA)樹脂的結(jié)合能力（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

Fig. 3: 從復(fù)雜混合物中純化：C-末端分選酶連接（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

在蛋白質(zhì)位點特異性標記研究方面，對C-末端標記和純化酶催化的生物交聯(lián)已成為一種用于將生物正交手柄與蛋白質(zhì)進行位點特異性結(jié)合有效且簡單的方法。與先前關(guān)于SrtA7M生物偶聯(lián)的報道一致，每種蛋白質(zhì)反應(yīng)混合物都以良好的收率獲得了所需的偶聯(lián)物（POI-LPET-pyTz）；對于除GFP和Her2-affibody之外的所有蛋白質(zhì)，通過ESI-MS分析，標記蛋白質(zhì)的百分比大于50%。反應(yīng)混合物中還存在與蛋白質(zhì)起始原料（POI-LPETGG）、SrtA7M酶和/或水解蛋白質(zhì)（POI-LPET）一致的雜質(zhì)（Fig. 3）。經(jīng)過洗柱、洗脫，通過UV-Vis確定蛋白質(zhì)回收率，并通過ESI-MS評估純度。對于每次洗脫，僅觀察到POI-LPET-pyTz偶聯(lián)物，回收率范圍為72-95%（Fig. 3）。此外，還使用GFP、SnapTag、5F7納米抗體和NanoLuc熒光素酶進行了測試，對于通過FPLC純化的每種蛋白質(zhì)，回收率都很高（>85%）。同時，作者也表征了ABC標記策略在N-端直接標記的應(yīng)用效果。為此，作者合成了ABC標記的CBT配體(3)，用于證明N-端直接標記單體鏈霉親和素2（mSA2），并通過ESI-MS確定標記蛋白質(zhì)的百分比（Fig. 4B）。純化后蛋白的ESI-MS包含一個對應(yīng)于mSA2-四嗪偶聯(lián)物的峰和一個由于單次氧化引起的小峰。mSA2-四嗪偶聯(lián)物的回收率為88%（Fig. 4）。

Fig. 4: 使用CBT連接純化N端修飾的mSA2（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

此外，為了驗證ABC標簽是否能夠從復(fù)雜混合物中實現(xiàn)目標蛋白質(zhì)的純化，作者從未知蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物中測試了ABC純化能力，將確定量的GFP-pyTz以低豐度摻雜到細菌細胞裂解混合物中（Fig. 5E）。通過Ni-IDA純化細菌裂解物，并以83%的收率回收純GFP-pyTz（>90%，凝膠）。

Fig. 5: ABC標簽蛋白質(zhì)混合物中對低豐度目標蛋白的純化表征（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）

最后，pyTz蛋白原位結(jié)合Ni-IDA樹脂用于純化目的的能力使作者考慮樹脂結(jié)合蛋白是否可以促進與游離sTCO蛋白對應(yīng)物的反應(yīng)以實現(xiàn)有效的蛋白偶聯(lián)。ABC標記的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物是在幾分鐘內(nèi)形成，通過二氫噠嗪接頭保持樹脂結(jié)合，并將雜質(zhì)沖走，用于實現(xiàn)高效的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合和純化。作者通過分選酶連接制備帶有sTCO(5)或pyTz(6)的C-末端Snap標簽的偶聯(lián)物。成功的C-末端連接的SnapTag偶聯(lián)物(7)通過二氫噠嗪接頭與樹脂保持結(jié)合，并通過ESI-MS和SDS-PAGE確定其完全洗脫（Fig. 6A）。證實了使用合成接頭不僅可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)二聚體偶聯(lián)，還可以擴大異三聚體的使用范圍。同時，使用合成接頭不僅可以實現(xiàn)直接蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合，還可以擴大獲得蛋白質(zhì)異源三聚體的途徑（Fig. 6B）。

Fig. 6: 樹脂上的蛋白質(zhì)偶聯(lián)反應(yīng)（圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.）