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納米孔道師法自然，模擬細胞膜表面蛋白質通道，其限域空間提供了最逼近實際生命體系中分子反應行為的場所，可實現(xiàn)在極短的時域內捕獲單個分子瞬態(tài)變化，從而探索基礎生物化學領域新現(xiàn)象、新規(guī)律和新知識提供可靠的單分子電化學測量方法。早在上世紀90年代，納米孔道最初作為一種生物傳感器開發(fā)應用于超靈敏核酸測序和無標記生物小分子的單分子傳感測量。經過近30年的發(fā)展，納米孔道單分子電化學分析技術已應用于DNA測序等。在DNA測序以外，近年來其在蛋白質檢測與測序、生物化學反應動態(tài)測量研究等方面顯示出獨特的優(yōu)勢。

南京大學化學化工學院龍億濤教授、應佚倫團隊長期致力于納米孔道電化學傳感機制與應用研究，積累了十多年的實驗實踐、理論認知以及儀器開發(fā)經驗。近日，龍億濤教授、應佚倫教授團隊與國際頂尖納米孔(道)研究團隊梳理回顧了近年來納米孔道電化學技術在蛋白質分析和測序、單分子共價化學、液體活檢臨床應用以及仿生納米孔道系統(tǒng)構建與應用等方面的發(fā)展現(xiàn)狀和主要挑戰(zhàn)，深入探討了納米孔道電化學“限域空間效應“為單分子測量技術帶來的新機遇、新挑戰(zhàn)和新應用。 

圖1：極具潛力納米孔道電化學單分子研究領域。

生物/化學功能化修飾賦予納米孔道理想的幾何尺寸和豐富的界面性質，有助于提高傳感靈敏度和選擇性，允許納米孔道從本體溶液中高效地捕獲、識別和傳輸各種分子和離子。在典型的納米孔道測量中，單個分析物分子在外加電場作用下進入納米孔道限域空間，擾動離子流動和分布，產生與分析物尺寸、電性、序列等相關的時序電流響應變化。通過解析單分子電信號的電流幅值與波動程度、持續(xù)時間和事件頻率等特征差異，納米孔道在單分子水平上實現(xiàn)了包括DNA、RNA、多肽、蛋白質、小分子代謝物及其復合物在內的多種生物分子的隨機傳感測量和表征。

從2004年使用α-溶血素納米孔道檢測多肽開始，納米孔道技術在蛋白組學研究方面取得了許多重要進展，包括多肽長度與體積表征、多肽/蛋白質翻譯后修飾識別與構象變化研究、蛋白質相互作用分析以及酶活性測定。最新研究利用DNA聚合酶或解旋酶控制DNA-多肽復合物單體順次過孔速度，實現(xiàn)了不超過17個氨基酸長度多肽片段的序列測定，實驗驗證了納米孔道蛋白質測序的可行性。

圖2：(a) 單分子蛋白質識別原理示意圖；(b) 基于ClpXP的蛋白質解折疊；(c) 實時監(jiān)測單分子多肽瞬態(tài)構象轉換。

蛋白質生物納米孔道具有天然的限域結構，可以作為優(yōu)秀的納米級反應器，其限域環(huán)境與聚合物單分子反應動力學密切相關，通過改變納米反應器內空間分離的活性基團的排布可實現(xiàn)化學反應選擇性的調控。研究發(fā)現(xiàn)，聚合物骨架中的二硫化物與納米孔道內半胱氨酸的反應強烈依賴于它們在納米孔道內的相對位置?；谙抻蚧瘜W選擇性，在納米孔道內構建半胱氨酸軌道，通過連續(xù)的硫醇-二硫化物交換反應，實現(xiàn)了DNA 單分子機器亞納米級步長的定向行走。

圖3：納米孔道限域單分子聚合物化學反應研究 

生物/固體納米孔道、蛋白質工程以及DNA納米技術的發(fā)展，為建造納米孔道仿生系統(tǒng)解決生物學難題提供了借鑒。經典范例包括：在固體納米孔道內修飾固有無序FG核孔蛋白(FG-Nups)成功構建了仿生核孔復合物，探究了并證實了FG-Nups網(wǎng)絡及其疏水殘基對核孔復合物選擇性的重要作用；利用可編程的DNA origami作為支架錨定FG-Nups得到仿生核孔復合物，借助顯微成像技術研究了受限FG-Nups的空間排列，該平臺能夠用于進一步探索不同類型FG-Nups形成的復雜度更高的網(wǎng)絡。

圖4：基于固體納米孔道與DNA origami的仿生核孔復合物構建

近幾年，納米孔道技術在臨床檢測應用方面取得了一系列進展。研究人員嘗試將納米孔道傳感器集成到微流控系統(tǒng)中，開發(fā)智能分析方法和設備用于臨床樣品制備和分析物濃縮；設計探針分子與體液樣本中的目標分析物特異性結合形成復合物，光電同步測量它們及其復合物的信號響應差異；在生物納米孔道（如OmpG、t-FhuA孔道）孔口處連接一個抗體或蛋白受體誘捕目標蛋白研究兩者結合/解離動力學，或者在孔道內裝配一個底物結合蛋白檢測體液樣本中葡萄糖、維生素B1等代謝物小分子的濃度。此外，通過選擇性降解背景分子增強檢測特異性同時規(guī)避對納米孔道結構功能的負面影響，最近報道了一種納米孔道數(shù)字計數(shù)方法，使用酶降解寡聚核苷酸探針與mRNA生物標志物結合后的背景分子，無需純化和PCR擴增，實現(xiàn)了臨床樣本中SARS-CoV-2冠狀病毒的準確測量。

圖5：納米孔道傳感技術的生物樣本檢測流程

未來納米孔道單分子電化學分析技術的發(fā)展仍面臨諸多機遇與挑戰(zhàn)，本文探討和展望了孔道構建、蛋白質分析、單分子化學、信息存儲以及生物醫(yī)藥與臨床診療等方面的應用，主要包括：生物、固體納米孔道的天然/非天然基團可控修飾；蛋白質納米孔道從頭設計和DNA origami納米孔道定制合成；構建合適的納米孔道限域環(huán)境精確控制單分子化學反應進程有望用于高效合成；開發(fā)大規(guī)模集成化便攜式納米孔道儀器系統(tǒng)提高傳感精度、時間分辨率和檢測效率，可實現(xiàn)準確快速揭示單分子聚合物(如蛋白質、多糖和脂類)的確切組成和單體序列，從而發(fā)展用于個體精準診療納米孔道單分子體外診斷技術。 

相關內容以“Nanopore-based technologies beyond DNA sequencing”為題發(fā)表在Nature Nanotechnology (2022, DOI: 10.1038/s41565-022-01193-2)上，應佚倫教授、胡正利副研究員為論文共同第一作者，南京大學為第一完成和通訊聯(lián)絡單位，牛津大學Hagan Bayley教授、代爾夫特理工大學Cees Dekker教授、以色列理工學院Amit Meller教授、格羅寧根大學Giovanni Maglia教授和南京大學龍億濤教授為共同通訊作者，該工作得到了國家自然科學基金(22027806, 21922405, 22106066)等支持。

文章連接為：

https://www.nature.com/articles/s41565-022-01193-2