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傳統(tǒng)的SPPS所采用的固定相（聚苯乙烯基質(zhì)交聯(lián)1-2%二乙烯苯）因其在水溶液中極低的溶脹而不能直接使用于ASPPS。與此不同，ChemMatrix （100% 聚乙二醇）樹脂符合這一技術(shù)要求。聚乙二醇具有雙親性質(zhì)，使其在諸如水、四氫呋喃、甲醇、二氯甲烷和二甲基甲酰胺等多種溶劑中展現(xiàn)出較好的溶脹效果。另外一種可以用于ASPPS的樹脂為PEGA樹脂。與純聚乙二醇為骨架的ChemMatrix樹脂不同，PEGA樹脂的骨架為聚乙二醇與聚丙烯酰胺嵌段共聚物。在溶脹方面，PEGA與ChemMatrix表現(xiàn)相當(dāng)。除此之外，聚乙二醇與氨甲基聚苯乙烯側(cè)鏈共聚產(chǎn)生的接枝共聚物（PEG-PS）和TentaGel樹脂（聚乙二醇與低交聯(lián)羥乙基聚苯乙烯）也可以作為ASPPS的固定相。ASPPS樹脂的功能性手臂與傳統(tǒng)的SPPS并無太大差異，比如Rink amide, HMPB (hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy-butyric acid)和HMBA (hydroxymethyl-benzoic acid)等。

使用于ASPPS的縮合試劑必須滿足：1） 在水溶液中具有相當(dāng)?shù)娜芙舛龋?）在水溶液中具有相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性；3）羧基活化后的穩(wěn)定性；4）羧基活化，以及酰胺鍵形成的較快反應(yīng)速率；5）低消旋副反應(yīng)等條件。符合以上要求并且經(jīng)常在ASPPS中廣泛應(yīng)用的縮合試劑，最常用的為EDC-HCl（也被稱做WSCD），已在多篇文獻(xiàn)中報(bào)道。EDC經(jīng)常與HONB，Oxyma, sulfo-HOSu等縮合添加物聯(lián)用?？蓱?yīng)用在ASPPS中的其它縮合試劑還包括DMTMM, TNTU, COMU （圖1）。

圖1. 常用ASPPS縮合試劑與添加劑 （圖片來源：Green Chem.）

有研究發(fā)現(xiàn)，HATU和PyBOP在水溶液中的縮合反應(yīng)表現(xiàn)劣于COMU。后者與2,6-二甲基哌啶聯(lián)用，在降低氨基酸消旋副反應(yīng)上有良好表現(xiàn)，并在ASPPS法合成低極性多肽方面實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用。TCFH (N,N,N’,N’-tetramethylchloroformamidinium hexafluorophosphate) 與三甲基哌啶介導(dǎo)的，在20 % PolarClean?（methyl 5-(dimethylamino)-2-methyl-5-oxopentanoate）水溶液中，以TentaGel S作為樹脂的ASPPS的表現(xiàn)比COMU 更優(yōu)秀 （圖2）。TNTU作為縮合試劑的作用在一項(xiàng)ASPPS對比實(shí)驗(yàn)中不如EDC，即便在HONB的存在下也表現(xiàn)不佳，其主因在于TNTU的水解。與此不同的是，DMTMM可以勝任50% 的乙醇水溶液中的縮合反應(yīng)，但在純水中的縮合效率低下。

圖2. TCFH和PolarClean化學(xué)結(jié)構(gòu)

實(shí)際上, N^α-Fmoc保護(hù)的氨基酸在很多綠色溶劑中的低溶解度限制了這些綠色溶劑的使用。對于水來說，這個(gè)問題更加突出。Fmoc-Xaa-OH在水中通常具備非常低的溶解度，極大阻礙了ASPPS。針對氨基酸溶解度的問題，一些新型N^α-保護(hù)基團(tuán)應(yīng)運(yùn)而生，并在ASPPS中驗(yàn)證了其價(jià)值。這些保護(hù)基包括Pms (2-[phenyl(methyl)sulfonio]ethyloxycarbonyl tetrafluoroborate, 2-[苯基(甲基)磺?；鵠乙氧羰基四氟硼酸鹽), Esc (ethanesulfonylethoxycarbonyl, 乙磺?；已趸驶?, Sps (2-(4-sulfophenylsulfonyl)ethoxycarbonyl, 2-(4-磺基苯磺?；?乙氧羰基)，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖3A所示。不難發(fā)現(xiàn)，這些Fmoc的替代物在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與Fmoc存在明顯相似點(diǎn)，即2-X-乙氧羰基，其中X為強(qiáng)拉電子基團(tuán)。與Fmoc一樣，這些N^α-保護(hù)基都可以與堿發(fā)生E1cB消除反應(yīng)，以及隨之而來的脫羧反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)N^α的脫保護(hù)（圖3B）。這些ASPPS的N^α-保護(hù)基團(tuán)，其X部分都含有親水結(jié)構(gòu)，而不同于Fmoc里高度疏水的芴Fluorenyl 。這個(gè)特征可以顯著增加N^α-保護(hù)氨基酸在水中的溶解度，從而滿足ASPPS對于氨基酸水溶液的濃度要求。這些新型的N^α-保護(hù)基氨基酸實(shí)現(xiàn)了Metenkephalin和Leu-enkephalin的水基固相合成。研究人員在這些項(xiàng)目中使用了PEG-PS樹脂，EDC, DMTMM或者TNTU 縮合試劑，以及HONB和sulfo-HOSu縮合添加劑。Pms-Xaa-OH 被EDC/HONB縮合，而Esc-或Sps-Xaa-OH的縮合反應(yīng)是在DIPEA的存在下進(jìn)行的。在所有這些ASPPS中，固相洗滌溶液為純水或0.2%的Triton X（曲拉通100）水溶液，后者可以增加樹脂的溶脹度。盡管這些新型N^α-保護(hù)基在ASPPS中得到了一定程度的應(yīng)用，但也存在與之俱來的缺陷，比如Pms的穩(wěn)定性問題，以及Esc在水溶液中脫保護(hù)不徹底的現(xiàn)象。

圖3. N^α-保護(hù)基團(tuán) Fmoc類似物，以及堿性環(huán)境脫保護(hù)反應(yīng)。（圖片來源：Green Chem.）

一種Fmoc的類似物，被稱作Smoc（2,7-disulfo-9-fluorenylmethoxycarbonyl，2,7-二磺基-9-芴基甲氧羰基）的N^α-保護(hù)基也在ASPPS中得到了使用。Smoc是Fmoc上2,7-位的2個(gè)H被磺酸基取代后衍生得到的（圖4），因?yàn)榛撬峄拇嬖冢鋲A敏感性和水溶液溶解度都得到了增強(qiáng)。其脫保護(hù)的方式與機(jī)理也與Fmoc相同。

圖4. Smoc保護(hù)基團(tuán)

在一系列Smoc-Xaa-OH參與的ASPPS反應(yīng)中，酰基載體蛋白 (ACP) 65–74 , oxytocin, 和vasopressin等多肽的合成得到了令人滿意的收率（大約72%）。研究者使用EDC作為縮合試劑，在測試的各種縮合添加劑中，oxyma的表現(xiàn)最佳，其次為HOPO。使用了HMPB-ChemMatrix和H-Rink amide-ChemMatrix樹脂。所有固相洗滌均通過水實(shí)現(xiàn)。Smoc的脫保護(hù)由1 M NaOH 水溶液（Rink amide-ChemMatrix樹脂）或5-10% 哌嗪水溶液完成。

盡管傳統(tǒng)的Fmoc 和Boc-氨基酸在水中的低溶解度阻礙了它們在ASPPS中的使用，但研究者還是嘗試了這些傳統(tǒng)SPPS原料在ASPPS方案中的利用可能。他們使用氧化鋯珠將這些氨基酸粉末研磨成納米顆粒，得到了 250-500 納米范圍的Fmoc-氨基酸納米顆粒和500-750 納米范圍的Boc-氨基酸，并將這些研磨后的納米顆粒的水懸浮液投入固定相進(jìn)行ASPPS合成（圖5）。通過這種手段，研究者以Fmoc-ASPPS方式在TentaGel樹脂上合成了一個(gè)五肽。固相洗滌液為純水，F(xiàn)moc脫保護(hù)試劑為0.1 M NaOH的90% 乙醇水溶液，縮合試劑組為EDC/HONB/DIPEA，最終得到了61%的五肽收率。在另一項(xiàng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，研究者使用Boc-氨基酸實(shí)現(xiàn)了89%收率的Leu-Enkephalin 的ASPPS合成?？s合試劑為DMTMM/NMM, 并使用含有少量TFA的4 M HCl溶液脫Boc。該實(shí)驗(yàn)者還發(fā)現(xiàn)，這種納米顆粒技術(shù)可以結(jié)合微波ASPPS完成長肽的合成。他們采取DMTMM/NMM縮合試劑，并且發(fā)現(xiàn)該合成方法可以明顯降低氨基酸消旋副反應(yīng)。例如Cys(Acm)的消旋從傳統(tǒng)有機(jī)溶劑介導(dǎo)的SPPS的10.5%降低到了0.5%；而His(Trt)的消旋率從13.8%減少到了3.3%。

圖5. Fmoc/Boc-氨基酸納米顆粒水懸浮液介導(dǎo)的ASPPS （圖片來源：Green Chem.）。

另外一組研究者通過2% (w/w) TPGS-750-M–H₂O膠束介質(zhì)實(shí)現(xiàn)了Z-氨基酸短肽（二至三肽）ASPPS合成, 其示意圖見圖6。

圖6. TPGS-750-M–H₂O水性膠束中的多肽合成（圖片來源：Green Chem.）

盡管三官能團(tuán)氨基酸的側(cè)鏈在傳統(tǒng)SPPS中通常是被保護(hù)的，但這些氨基酸中除了Cys的巰基，Lys的氨基和Asp/Glu的羧基之外，其余官能團(tuán)可以在不被保護(hù)的情況下參與多肽合成，比如Ser/Thr的羥基，His的咪唑基，Tyr的酚羥基，Asn/Gln的酰胺基，Trp的吲哚基和Arg的胍基。這些非極性保護(hù)基團(tuán)的去除，可以增加主體氨基酸自身的親水性，并提高它們在水溶液中的溶解度，無論從增加原子經(jīng)濟(jì)性，降低PMI，還是實(shí)現(xiàn)綠色ASPPS的角度來看，擺脫不必要氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基都是有益的。有研究者成功使用側(cè)鏈不保護(hù)的Pms-Tyr-OH和Esc-Tyr-OH作為原料合成了Met-Enkephalin和Leu-Enkephlin。

本文作者在最后總結(jié)了文獻(xiàn)報(bào)道的ASPPS實(shí)例（表1）。

表1. 文獻(xiàn)報(bào)道ASPPS實(shí)例總覽（圖片來源：Green Chem.）

在綠色化學(xué)方興未艾的當(dāng)今，傳統(tǒng)的固相多肽合成面臨過度使用有害有機(jī)溶劑的瓶頸，也因此受到環(huán)境與監(jiān)管部門的挑戰(zhàn)。在這種大環(huán)境下，開發(fā)多肽合成的綠色溶劑成為整個(gè)行業(yè)的關(guān)注點(diǎn)。本文重點(diǎn)介紹了水作為溶劑介導(dǎo)多肽固相合成的技術(shù)，從樹脂、縮合試劑、N-保護(hù)基，以及側(cè)鏈保護(hù)基的角度，討論了該技術(shù)和工藝的可應(yīng)用性，并列舉了水基多肽固相合成的成功案例。

盡管相較于綠色有機(jī)溶劑引發(fā)的多肽生產(chǎn)變革，水基固相多肽合成的工業(yè)應(yīng)用有待增強(qiáng)，但它代表了綠色多肽合成的一種發(fā)展方向。在樹脂基質(zhì)，縮合試劑，N^α-保護(hù)基的共同進(jìn)化下，ASPPS有望取得更大的應(yīng)用價(jià)值。

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