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在自然界中，許多蛋白質(zhì)組裝成特定的寡聚結(jié)構(gòu)，其中包含多個(gè)不同蛋白質(zhì)的精確數(shù)量和寡聚序列。這種組裝可以決定蛋白質(zhì)的生物學(xué)特性（例如，人IgM抗體包含五個(gè)蛋白質(zhì)亞基）、催化特性（例如，真核RNA聚合酶II包含十二個(gè)蛋白質(zhì)亞單位）、光物理特性（例如，藍(lán)藻光系統(tǒng)I包含十二個(gè)蛋白亞基）、和膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性（例如，青鏈霉菌鉀通道包含四個(gè)蛋白質(zhì)亞單元）。為了模仿并可能超越這些特性，需要對不同的蛋白質(zhì)寡聚體進(jìn)行模塊化合成。盡管使用分子生物學(xué)技術(shù)（包括基因工程和突變蛋白質(zhì)的重組表達(dá)）可以實(shí)現(xiàn)制備（Fig. 1A）。然而，通過重組表達(dá)制備許多蛋白質(zhì)具有挑戰(zhàn)性（例如，具有翻譯后修飾的蛋白質(zhì)、具有二硫鍵的蛋白質(zhì)、毒蛋白質(zhì)、或聚集的蛋白質(zhì)），這可能限制了通過這些方法可以寡聚的蛋白質(zhì)的范圍。此外，化學(xué)方法是另一種控制寡聚的強(qiáng)大方法，如在基于特定位點(diǎn)進(jìn)行非天然氨基酸的融合表達(dá)和附著在化學(xué)支架上進(jìn)行組裝（Fig. 1B）。然而，前者如果沒有廣泛的化學(xué)設(shè)計(jì)、蛋白質(zhì)氨基酸序列的修飾和/或重組蛋白表達(dá)，獲得大于二聚體或三聚體的單分散和序列編碼低聚物是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。而后者必須改變DNA設(shè)計(jì)，以合成含有不同數(shù)量或寡聚序列的蛋白質(zhì)寡聚體，這些限制大大阻礙了蛋白質(zhì)寡聚體的構(gòu)建和后續(xù)研究。

為了解決上述限制，作者提出了一組特定的DNA鏈可以用作模塊化支架，將蛋白質(zhì)組織成具有精確化學(xué)計(jì)量和寡聚序列的寡聚體（Fig. 1C）。這種DNA設(shè)計(jì)將使不同的蛋白質(zhì)精確地組織成一系列單分散、序列編碼的低聚物（Fig. 1Ci）。

Fig. 1: 蛋白質(zhì)低聚技術(shù)及其局限性 （圖片來源：Chem）

為了驗(yàn)證上述想法，作者選擇三種通常用作檢查點(diǎn)抑制劑的市售IgG抗體（即抗小鼠PD-1[A]、抗小鼠TIGIT[B]和抗小鼠CTLA-4[C]），使用模塊化DNA支架進(jìn)行蛋白質(zhì)的序列編碼寡聚。為了將單個(gè)DNA鏈安裝到A、B或C上，將每個(gè)抗體與2當(dāng)量含有N-羥基琥珀酰亞胺活化酯和疊氮化物（NHS–PEG12–N3）的低聚（乙二醇）分子反應(yīng)45分鐘（Fig. 2A）。在通過尺寸排阻色譜（SEC）純化后，每個(gè)抗體表面上的疊氮化物與5當(dāng)量含有二苯并環(huán)辛炔（DBCO）和熒光團(tuán)的DNA鏈和兩個(gè)不同的20堿基核酸序列進(jìn)行疊氮化合物-炔環(huán)加成（SPAAC）反應(yīng)。16小時(shí)后，約25%-30%的抗體被一條DNA鏈修飾。接下來，使用SEC從反應(yīng)混合物中去除未反應(yīng)的DNA。使用陰離子交換色譜法從未反應(yīng)的抗體和用多條DNA鏈官能化的抗體中分離出用單條DNA鏈功能化的抗體（Fig. 2A）。之后，制備了三種不同的蛋白質(zhì)DNA綴合物（即S2–A–Cy3–S3、S4–B–Cy5–S5和S6–C–FITC–S1），并通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，F(xiàn)ig. 2B）和SEC確認(rèn)其含有單一DNA功能化。

Fig. 2: 單鏈DNA的抗體功能化 （圖片來源：Chem）

通過將純化的蛋白質(zhì)DNA綴合物（Fig. 3A和3E：lane 1-3）與模板DNA鏈混合來合成蛋白質(zhì)低聚物。等量的B-DNA綴合物、C-DNA綴合物、S50-60模板鏈、S50-S60模板鏈，混合S10-S20模板鏈以合成具有寡聚序列S4-B-C-S20的蛋白質(zhì)二聚體（Fig. 3B），組裝產(chǎn)率為68%。由于不存在與S4或S20 DNA序列互補(bǔ)的DNA序列，因此在組裝混合物中未觀察到含有多于兩個(gè)抗體的低聚物。使用SEC純化從組裝混合物中的未反應(yīng)單體和模板鏈中分離蛋白質(zhì)二聚體，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行表征（Fig. 3E: lane 4）。瓊脂糖凝膠顯示二聚體的單一條帶，僅具有預(yù)期的Cy5和FITC熒光，電泳遷移率低于單獨(dú)的抗體-DNA偶聯(lián)物。結(jié)果表明，成功合成了具有寡聚序列S4-B-C-S20的單分散和序列編碼的蛋白質(zhì)二聚體。

Fig. 3: 利用DNA-DNA相互作用將抗體寡聚成編碼序列 （圖片來源：Chem）

接下來，作者將等量的A-DNA綴合物、B-DNA綴合物、C-DNA綴合物、S30-S40模板鏈和S50-S60模板鏈混合，以27%的組裝產(chǎn)率合成具有寡聚序列S2-A-B-C-S1的蛋白質(zhì)三聚體并通過瓊脂糖凝膠電泳對其進(jìn)行表征（Fig. 3C，3E: lane 5）。此外，作者使用抗原結(jié)合和檢查點(diǎn)抑制劑活性細(xì)胞測定法研究了用DNA功能化和用模塊化DNA支架寡聚后人抗體的靶向結(jié)合特性。結(jié)果表明，每個(gè)樣品中保留了抗原結(jié)合和檢查點(diǎn)抑制劑活性。

最后，作者使用蛋白質(zhì)二聚體和三聚體作為構(gòu)建模塊成功合成了具有寡聚序列S4–B–C–A–B–C–S1的單分散和序列編碼的蛋白質(zhì)五聚體，其中三種不同的抗體被組織成精確的低聚物序列（Fig. 3D，3E: lane 6）。這是第一個(gè)報(bào)道的單分散抗體五聚體，其包含預(yù)定義寡聚序列中的不同抗體。

總結(jié)：

Chad A. Mirkin院士團(tuán)隊(duì)展示了如何使用可推廣的生物偶聯(lián)化學(xué)和精心設(shè)計(jì)的DNA支架合成單分散、序列編碼的蛋白質(zhì)低聚物。因?yàn)檫@種通用的蛋白質(zhì)低聚方法可以合成具有不同化學(xué)計(jì)量和低聚物序列的低聚物，而無需重新設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)或DNA支架，表現(xiàn)出了其強(qiáng)大性和實(shí)用。更為重要的是，這一合成進(jìn)展將使后續(xù)研究和理解蛋白質(zhì)低聚物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)之間的基本關(guān)系成為可能，這對許多領(lǐng)域（如治療學(xué)、催化、光合作用和膜運(yùn)輸）具有重大意義。