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由于全球老年人癡呆癥患病率不斷上升以及對(duì)社會(huì)的影響越來(lái)越大，阿爾茨海默癥(AD)已經(jīng)引起了越來(lái)越多的關(guān)注，其中對(duì)AD發(fā)病機(jī)制和診斷方法的研究一直處于醫(yī)學(xué)和腦科學(xué)的前沿。目前，AD的診斷主要基于使用多種常規(guī)神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試和醫(yī)療器械(CT、PET、MRI)進(jìn)行的臨床評(píng)估。此外，臨床上還包括對(duì)血漿或腦脊液中的生物標(biāo)志物的檢查，以估計(jì)疾病的發(fā)展進(jìn)程。但是，這些方法都很難滿足AD診斷所需的敏感性、特異性和非侵入性。

熒光成像因其高靈敏度、微創(chuàng)和實(shí)時(shí)響應(yīng)的特性而在生物分析領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。在此背景下，針對(duì)AD生物標(biāo)志物設(shè)計(jì)的熒光探針將為AD診斷和病理分析提供強(qiáng)有力的工具。當(dāng)前，對(duì)AD早期診斷的研究大多集中在Aβ肽或tau蛋白上，而很少能夠在活體水平上揭示氧化應(yīng)激與AD之間的復(fù)雜關(guān)系。作為超氧自由基和一氧化氮的組合產(chǎn)物，過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO^-)是一種典型的氧化應(yīng)激反應(yīng)物種，已有證據(jù)表明，ONOO^-通過(guò)引發(fā)神經(jīng)毒性和神經(jīng)炎癥在AD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。但是，迄今為止，還沒(méi)有ONOO^-熒光探針可用于AD的活體腦成像。造成這種困境的一個(gè)主要原因可能是當(dāng)前探針的血腦屏障(BBB)穿越能力不足。此外，由于大腦中產(chǎn)生的ROS種類繁多，也要求探針對(duì)ONOO^-具有優(yōu)異的選擇性。鑒于此，劉志洪教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)策略合理設(shè)計(jì)了一種新穎的ONOO^-激活的近紅外發(fā)射熒光探針Rd-DPA3，旨在研究過(guò)氧亞硝酸鹽與AD之間的復(fù)雜關(guān)系，實(shí)現(xiàn)AD進(jìn)展過(guò)程的體內(nèi)診斷和評(píng)估（圖1）。

圖 1. 探針Rd-DPA3的結(jié)構(gòu)及作用示意圖（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

在探針?lè)肿拥臉?gòu)建中，首先基于前期工作中發(fā)展的二氨基取代的Rhodol染料(NIR-Rd-1和NIR-Rd-2)，作者利用剛性五元環(huán)鎖定類哌嗪類二氨基結(jié)構(gòu)并接枝氯原子開發(fā)了一種新型Rhodol染料NIR-Rd-3，其具有更長(zhǎng)的近紅外發(fā)射波長(zhǎng)。此外，考慮到ONOO^-的強(qiáng)氧化性和親核性，4, 4'-氮雜二基二苯酚被創(chuàng)新性地開發(fā)為對(duì)ONOO^-具有高選擇性的識(shí)別基團(tuán)，進(jìn)而連接到NIR-Rd-3熒光團(tuán)上獲得了ONOO^-可激活的熒光探針Rd-DPA3。接著，作者首先通過(guò)滴定實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了探針Rd-DPA3對(duì)ONOO^-的響應(yīng)性能。在沒(méi)有ONOO^-存在的條件下，Rd-DPA3的最大吸收峰位于602 nm，同時(shí)在702 nm處顯示微弱的熒光。而在加入ONOO^-反應(yīng)后，Rd-DPA3在700 nm處的熒光顯著增強(qiáng)，同時(shí)吸收藍(lán)移至572 nm。重要的是，Rd-DPA3對(duì)ONOO^-表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和選擇性，檢測(cè)限低至3.4 nM，其他干擾物質(zhì)（金屬離子，pH，ROS, 蛋白質(zhì)）均不會(huì)引起探針在700 nm處的熒光增強(qiáng)。在不同pH條件下，探針均具有良好的穩(wěn)定性，并且能夠維持對(duì)ONOO^-出色的響應(yīng)能力（圖2）。

圖 2. Rd-DPA3對(duì)ONOO^-的光譜響應(yīng)（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

然后，作者進(jìn)一步通過(guò)高分辨質(zhì)譜研究了Rd-DPA3與ONOO^-的反應(yīng)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在單分子Rd-DPA3中，ONOO^-首先進(jìn)攻雙氨基酚部分形成烷基胺修飾的熒光團(tuán)，隨后烷基胺基團(tuán)繼續(xù)與ONOO^-發(fā)生1, 3-消除反應(yīng)生成NIR-Rd-3。對(duì)于Rd-DPA3，4, 4'-氮雜二基二酚基團(tuán)不僅是ONOO^-的反應(yīng)位點(diǎn)，而且還可以通過(guò)PeT效應(yīng)有效地淬滅NIR-Rd-3的熒光。此外，密度泛函理論(DFT)計(jì)算也與作者提出的檢測(cè)機(jī)制一致（圖3）。

圖 3. Rd-DPA3與ONOO^-反應(yīng)機(jī)制的探究（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

接著，作者在活細(xì)胞中研究了探針Rd-DPA3的成像能力。首先，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該探針具有良好的生物相容性和線粒體定位性能，并且可以選擇性地反映活細(xì)胞中外源性和內(nèi)源性O(shè)NOO^-濃度的變化。由于金屬離子(Fe²⁺, Cu²⁺等)穩(wěn)態(tài)的紊亂與AD的進(jìn)展密切相關(guān)，作者進(jìn)一步通過(guò)在PC12細(xì)胞中添加Fe²⁺，模擬AD過(guò)程中由于金屬離子穩(wěn)態(tài)失衡所導(dǎo)致氧化應(yīng)激的細(xì)胞模型。。結(jié)果顯示，隨著Fe²⁺濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)熒光逐漸增強(qiáng)，表明在Fe²⁺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過(guò)程中產(chǎn)生了ONOO^-。值得注意的是，加入尿素（UA，一種高效的ONOO^-清除劑）后，PC12細(xì)胞中的紅色熒光信號(hào)急劇降低，這表明UA有效降低了細(xì)胞內(nèi)ONOO^-水平。同時(shí)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了Rd-DPA3能夠監(jiān)測(cè)AD細(xì)胞模型中ONOO^-的波動(dòng)（圖4）。

圖 4. AD細(xì)胞模型中ONOO^-的監(jiān)測(cè)（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

隨后，作者進(jìn)行了活體成像的研究。首先，作者評(píng)估了探針的血腦屏障(BBB)穿透能力。經(jīng)計(jì)算，55.54%的Rd-DPA3成功穿透了人工模擬BBB，顯示出探針在體內(nèi)腦成像的巨大潛力。然后，探針經(jīng)過(guò)尾靜脈注射到各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的小鼠模型中。在AD模型小鼠中，熒光強(qiáng)度在0-6小時(shí)內(nèi)顯著升高，并在6-11小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定；相比之下，在對(duì)照組中只能觀察到輕微的熒光增強(qiáng)，從而證明ONOO^-的過(guò)度表達(dá)是AD的標(biāo)志之一。此外，為了確認(rèn)注射后探針集中在小鼠大腦中，解剖小鼠大腦進(jìn)行了離體NIR成像。體外成像結(jié)果表明，AD模型腦部的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了探針在腦中的BBB穿越能力和ONOO^-檢測(cè)性能。同時(shí)，在氯碘羥喹或姜黃素（兩種著名的治療阿爾茨海默病的化學(xué)藥物）處理的AD小鼠中，腦部的實(shí)時(shí)熒光成像表明ONOO^-表達(dá)在0-12小時(shí)下降到低水平。這樣的結(jié)果表明Rd-DPA3可以通過(guò)測(cè)量大腦中的ONOO^-水平來(lái)幫助藥理學(xué)家研究藥物在治療阿爾茨海默病中的作用機(jī)制（圖5）。除此之外，作者進(jìn)一步對(duì)不同年齡AD大腦中ONOO^-的積累進(jìn)行了研究。3個(gè)月，8個(gè)月和12個(gè)月大的AD模型小鼠分別被注射了Rd-DPA3，并記錄了小鼠的實(shí)時(shí)成像。結(jié)果顯示，來(lái)自大腦的熒光信號(hào)隨著年齡的增長(zhǎng)而顯著增加，為AD大腦中ONOO^-的年齡依賴性積累提供了體內(nèi)證據(jù)（圖6）。

圖 5. AD小鼠中ONOO^-的體內(nèi)成像（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

圖 6. ONOO^-在年齡相關(guān)AD小鼠中的體內(nèi)成像（圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）

湖北大學(xué)劉志洪教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)優(yōu)化策略合理設(shè)計(jì)了一種過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO^-)可激活的熒光探針Rd-DPA3，其表現(xiàn)出優(yōu)異的靈敏度和選擇性。在細(xì)胞水平上，Rd-DPA3能夠靶向線粒體并監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中ONOO^-濃度在氧化應(yīng)激過(guò)程的變化。此外，由于Rd-DPA3優(yōu)異的BBB穿透能力，首次在AD小鼠模型的大腦中成功實(shí)現(xiàn)了ONOO^-濃度波動(dòng)的實(shí)時(shí)體內(nèi)成像，并證明了阿爾茨海默癥(AD)小鼠大腦中ONOO^-含量會(huì)隨年齡的增長(zhǎng)呈現(xiàn)依賴性積累。該研究結(jié)果有力地支撐了ONOO^-可以作為AD的生物標(biāo)志物，進(jìn)一步促進(jìn)了我們對(duì)AD診斷和治療的認(rèn)識(shí)，為新型ONOO^-探針設(shè)計(jì)和AD診斷提供了新的方向。

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