国产女人喷潮视频在线观看,国产精品欧美成人片,91九色国产成人久久精品,成在线人免费无码高潮喷水,亚洲日韩成人无码不卡网站,久久久久国产一级毛片高清板,国产一二视频,丰满少妇av无码区,久久永久免费人妻精品我不卡 ,国产伦子系列沙发午睡

基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PeT)原理的傳感器通常是依賴于PeT進(jìn)入激發(fā)態(tài)(受體PeT)或脫離激發(fā)態(tài)(供體PeT)進(jìn)行信號傳輸?shù)?。近期，加州大學(xué)伯克利分校的Evan W. Miller教授課題組通過引入吸電子分子導(dǎo)線來反轉(zhuǎn)電子流動的方向，首次開發(fā)了供體PeT (d-PeT) 型電壓敏感熒光染料(VF)。在該設(shè)計中，含有吸電子基團(tuán)的VF染料具有電壓敏感熒光特性，但是和受體PET (a-PET) 型電壓敏感熒光染料的極性是相反的，在超極化生物膜電位狀態(tài)下會增強(qiáng)熒光。相關(guān)成果以“Flipping the Switch: Reverse-Demand Voltage-Sensitive Fluorophores”為題發(fā)表于J. Am. Chem. Soc. (DOI: 10.1021/jacs.2c05385)。

生物膜電位(V_m)源于選擇性滲透脂質(zhì)雙層中離子濃度的差異，是生命的決定性特征。使用熒光指示劑可視化細(xì)胞V_m為傳統(tǒng)電極方法提供了強(qiáng)大的補(bǔ)充，并力求解決與電生理學(xué)相關(guān)的低通量、空間分辨率差和侵入性問題。熒光染料長期以來一直用于監(jiān)測生物學(xué)相關(guān)的分析物、反應(yīng)和性質(zhì)。光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PeT)的調(diào)控是設(shè)計熒光報告分子的有效方法，是通過基于與分析物（如離子和反應(yīng)性代謝物）的結(jié)合或反應(yīng)控制PeT進(jìn)入或退出熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)。

作者在前期研究中一直在探索基于PeT的傳感器來監(jiān)控V_m。他們假設(shè)電壓敏感熒光團(tuán)內(nèi)的電壓敏感性來自于對V_m敏感的電子轉(zhuǎn)移，因此電子轉(zhuǎn)移的方向很重要。在超極化V_m下，當(dāng)電子從質(zhì)膜中的分子導(dǎo)線移動到細(xì)胞外表面的熒光團(tuán)中時，會發(fā)生PeT，染料的發(fā)光得到淬滅；而在去極化的V_m下，電壓降低了PeT的速率，染料的熒光得到增強(qiáng)。與這一假設(shè)一致，電壓敏感熒光染料(VF)在膜去極化時具有熒光開啟響應(yīng)、納秒響應(yīng)動力學(xué)和電壓依賴性熒光壽命。當(dāng)前，所有VF染料都是使用含苯胺的分子導(dǎo)線在受體PeT (a-PeT) 結(jié)構(gòu)中實(shí)現(xiàn)電壓敏感性，其中熒光團(tuán)充當(dāng)電子受體。然而，如果關(guān)于電壓傳感機(jī)制的假設(shè)是正確的，用吸電子基團(tuán)(EWG)代替富電子苯胺應(yīng)該會降低導(dǎo)線的前沿分子軌道能量并實(shí)現(xiàn)供體激發(fā)的PeT (d-PeT)。在這種結(jié)構(gòu)中，超極化的V_m會降低PeT的速率，因而導(dǎo)致超極化電位下的熒光增亮（圖1）。基于此，作者計算了一系列含有EWG取代基的分子導(dǎo)線的HOMO/LUMO能量，合成了5種新的EWG-VF染料，表征了它們的光譜特性，并評估了它們在哺乳動物細(xì)胞中的電壓敏感性。其中，兩種新染料顯示出電壓敏感性，但相對于先前報道的含苯胺的VF染料極性相反（圖2）。

圖 1. 電壓敏感熒光團(tuán)中的PeT過程（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖 2. 含EWG的VF染料的合成（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

首先，為了研究通過d-PeT反轉(zhuǎn)VF染料極性的可能性，作者進(jìn)行了密度泛函理論(DFT)計算以預(yù)測正交熒光團(tuán)和分子導(dǎo)線體系中的相對HOMO/LUMO能量 （圖3）。對于像4-NO₂-VF這樣的EWG-VF染料，作者發(fā)現(xiàn)4-NO₂-VF的導(dǎo)線LUMO比熒光素LUMO低-0.58 eV，表明可能存在d-PeT。同時，作者計算了包含其他EWG的分子導(dǎo)線的軌道能量。其中，4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF都具有大約-0.6 eV或更大的LUMO?LUMO (L?L) 間隙?；诖?，作者認(rèn)為用4-NO₂和2,4-diNO₂等強(qiáng)EWG取代可能會生成d-PeT VF染料。

圖 3. 密度泛函理論(DFT)計算（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

為了驗(yàn)證VF染料可以“反向運(yùn)行”的假設(shè)，作者合成了5種不同的EWG取代的二苯乙烯衍生物。由于具有相同的熒光團(tuán)，所有EWG-VF染料的最大吸收均位于511 nm處，最大熒光發(fā)射位于527 nm （圖4），而染料的熒光量子產(chǎn)率范圍為0.09-0.71。其中，4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF都具有低熒光量子產(chǎn)率，表明了高度的PeT淬滅效應(yīng)。而且，在高濃度硫醇（2 mM谷胱甘肽）的存在情況下，EWG-VFs表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性。

圖 4. VF染料的光譜性質(zhì)（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接著，實(shí)驗(yàn)表明所有EWG-VF染料都可染色HEK293T細(xì)胞的質(zhì)膜（圖5），4-NO₂-VF的膜染色最亮。然后，作者使用全細(xì)胞膜片鉗電生理學(xué)評估了HEK293T細(xì)胞中新型EWG-VF染料的電壓敏感性（圖6）。結(jié)果顯示，具有4-NO₂取代基的EWG-VF染料表現(xiàn)出電壓敏感性，但極性相反，4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF 的熒光在去極化時降低，在超極化時變得更亮。但是，2,4-diNO₂-VF在細(xì)胞中顯示出非常弱的熒光，比4-NO₂-VF低約40倍，因此作者利用4-NO₂-VF進(jìn)一步監(jiān)測了大鼠海馬神經(jīng)元中的誘發(fā)動作電位(AP)。在單次試驗(yàn)中，4-NO₂-VF報告的AP平均ΔF/F為-1.3%±0.14，信噪比(SNR)為9.1±1.0。對神經(jīng)元AP去極化的反應(yīng)是熒光降低，表明d-PeT指示劑能夠在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中起作用。

圖 5. 細(xì)胞成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖 6. 含EWG的VF染料在活細(xì)胞中的電壓敏感性（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接著，在比-100 mV更負(fù)的超極化電位下，4-NO₂-VF變得更亮，實(shí)現(xiàn)了+2.4%的超極化開啟響應(yīng)。在極端超極化電位下，光學(xué)響應(yīng)偏離-100和+100 mV之間觀察到的線性。超極化電位在抑制性神經(jīng)傳遞中發(fā)揮重要作用，更廣泛地說，在線粒體的生理學(xué)中發(fā)揮重要作用，其中靜息線粒體電位在-100 -200 mV的范圍內(nèi)。最后，作者證明了4-NO₂-VF可用于V_m動態(tài)的雙色映射，表明d-PeT方法能夠提供快速響應(yīng)動力學(xué)并且與雙色成像兼容（圖 7）。

圖 7. 4-NO₂-VF在超極化電位下的電壓敏感性（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

加州大學(xué)伯克利分校的Evan W. Miller教授課題組報道了基于d-PeT的電壓敏感熒光染料的設(shè)計、合成和驗(yàn)證。在該工作中，作者合成了5種不同的吸電子基團(tuán)取代的熒光染料，表征了它們的光譜特性，并評估了它們在哺乳動物細(xì)胞中的電壓敏感性。其中4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF都是電壓敏感的，可作為超極化的開啟指示器。而且，4-NO₂-VF被成功應(yīng)用于活細(xì)胞中，在超極化生物膜電位狀態(tài)下顯示出增強(qiáng)的熒光信號。

文獻(xiàn)詳情：