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近些年發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas12a分子檢測技術(shù)與RPA擴增表現(xiàn)出了良好的互補性：RPA擴增可顯著提高CRISPR/Cas12a的檢測靈敏度，CRISPR/Cas12a技術(shù)能夠消除RPA非特異性擴增產(chǎn)生的假陽性信號[1]。但是，RPA擴增和CRISPR/Cas12a反應(yīng)的簡單混合通常會導(dǎo)致靈敏度的急劇下降或檢測時間的延長，其主要原因是模板DNA和擴增子激活Cas12a酶的切割活性后，會被順式切割導(dǎo)致模板失效；與此同時激活后的Cas12a核酸酶還會反式切割單鏈引物，造成RPA擴增效率急劇下降[2]。為避免擴增子轉(zhuǎn)移造成的氣溶膠污染，目前大多數(shù)的RPA擴增和CRISPR技術(shù)結(jié)合的研究都是在密封體系內(nèi)將RPA擴增和CRISPR檢測物理分隔。如：王永明將CRISPR體系加至PCR管蓋上，擴增完成后經(jīng)過離心步驟混合進行后續(xù)的CRISPR反應(yīng)[3]；劉長春團隊利用蔗糖的濃度梯度分隔RPA擴增和CRISPR反應(yīng)[4]。這些方法雖然實現(xiàn)了“閉管”檢測，但對操作要求較高，與即時診斷（Point of Care Test, POCT）策略相背。因此，開發(fā)出易于推廣的、可實現(xiàn)自動化的RPA-CRISPR“閉管”檢測新方法對于RPA恒溫擴增技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用具有重要的意義。

2022年6月28日，深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院劉翼振副教授在Analytical Chemistry上發(fā)表了題為“Photoactivatable CRISPR/Cas12a strategy for One-pot DETECTR Molecular Diagnosis”的研究。該研究利用光控技術(shù)精確控制CRISPR/Cas12a反應(yīng)的開啟，避免了RPA擴增初期Cas12a核酸酶對模板、擴增子以及引物的消耗，解決了RPA-CRISPR反應(yīng)簡單混合導(dǎo)致的靈敏度急劇下降和檢測時間延長等問題，實現(xiàn)了“閉管”的、無需擴增子轉(zhuǎn)移的、高靈敏的分子診斷。

在基因編輯領(lǐng)域，“光激活”作為一種無創(chuàng)、快速、高分辨率的生化反應(yīng)開關(guān)常常被用于Cas9技術(shù)在體內(nèi)基因編輯的控制器[5,6]。受此啟發(fā)，作者提出光控的RPA-CRISPR/Cas12a分子檢測新技術(shù)：設(shè)計能夠與crRNA完全互補的、中間穿插有光解基團的PC-DNA，二者雜交后能夠阻止crRNA形成“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)與Cas12a核酸酶結(jié)合，從而阻斷CRISPR/Cas12a反應(yīng)（圖1a）。所以，在檢測的前15 min，RPA擴增可以在無干擾的情況下迅速生成大量擴增子。然后使用365 nm紫外光照射3 min使光解基團PC-DNA斷裂并從crRNA上解離，釋放出的crRNA與Cas12a結(jié)合并被擴增子激活。因此，在檢測的后20 min，CRISPR/Cas開啟反式切割迅速切斷熒光報告鏈產(chǎn)生熒光信號（圖1b）。

圖1 光控的RPA-CRISPR/Cas“閉管”檢測（圖源：Chen Y, et  al., Anal Chem, 2022）

基于此，作者設(shè)計了W-PC-DNA、F-PC-DNA和R-PC-DNA三種PC-DNA分別與crRNA的全長序列、發(fā)卡序列和識別序列互補，用以測試其保護效果。結(jié)果表明只有完全封閉crRNA的全長序列時，檢測體系才能夠達(dá)到預(yù)期的效果，并且PC-DNA的最優(yōu)加入量為crRNA的2倍（圖2a）。為了縮短整體檢測時間，作者進一步證實了在低濃度模板（25 copies）下，RPA預(yù)擴增和光激活CRISPR所需的最短時間分別為15 min和3 min，因此整個的檢測過程為38 min（圖2b）。

圖2 光控的RPA-CRISPR/Cas檢測條件優(yōu)化（圖源：Chen Y, et  al., Anal Chem, 2022）

 最后，作者利用這一技術(shù)實現(xiàn)了對非洲豬瘟（African Swine Fever Virus, ASFV）的快速檢測。進一步的，作者以豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirus Type 2, PCV2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV）作為對比驗證了其特異性，并且證實了該檢測體系的檢測靈敏度達(dá)到了2.5 copies/reaction（圖3a）。與常規(guī)的先RPA擴增后CRISPR/Cas加入的分步式檢測方法相比，光控的RPA-CRISPR“閉管”檢測方法在靈敏度一致的前提下，極大地簡化了操作流程（圖3b）。

圖3 光控的RPA-CRISPR/Cas檢測與分步檢測對比（圖源：Chen Y, et  al., Anal Chem, 2022）

綜上所述，本研究建立了一種光激活、“閉管”的RPA-CRISPR/Cas分子診斷新方法，并將其用于非洲豬瘟病毒的快速檢測。該研究利用互補的、含有光解基團的PC-DNA與crRNA雜交從而阻斷CRISPR/Cas12a反應(yīng)，然后擴增完成后通過365 nm紫外光照釋放crRNA恢復(fù)CRISPR/Cas12a的活性進行核酸檢測。該方法在“閉管”系統(tǒng)中實現(xiàn)了RPA擴增-光激活CRISPR/Cas12a檢測的精確控制，解決了傳統(tǒng)RPA-Cas12a集成檢測中由于競爭反應(yīng)導(dǎo)致靈敏度降低和檢測時間延遲的問題。整個檢測時間僅為40 min，檢測靈敏度為2.5 copies。與目前的分離RPA-CRISPR/Cas檢測相比，該方法操作簡單、控制精準(zhǔn)、避免了擴增子轉(zhuǎn)移帶來的氣溶膠污染問題。這種光激活的RPA-CRISPR/Cas12a“閉管”檢測方法在POCT核酸檢測中將發(fā)揮重要作用，具有較高的應(yīng)用價值。

深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院副研究員陳勇為研究論文的第一作者，劉翼振副教授為通訊作者。該研究獲得了國家自然科學(xué)基金委員會、廣東省自然科學(xué)基金、深圳市科技創(chuàng)新委員會、深圳大學(xué)的大力支持。

通訊作者課題組簡介：

劉翼振團隊成員長期從事DNA等溫信號放大技術(shù)、DNA級聯(lián)電路、核酸等溫擴增及CRISPR分子診斷技術(shù)的研究工作。研究內(nèi)容主要圍繞生物傳感技術(shù)與分子診斷技術(shù)，結(jié)合分析化學(xué)、分子生物學(xué)及生物醫(yī)學(xué)工程開展新型分子診斷技術(shù)的交叉研究。近五年在ACS Nano、Advanced Science、Chemical Science、Analytical Chemistry、Journal of Materials Chemistry A、Chemical Communications、Topics in Current Chemistry、Analytica Chimica Acta、Talanta 等期刊發(fā)表多篇研究論文。長期擔(dān)任ACS Nano、Advanced Materials、Advanced Functional Materials、Chemical Communications和Nanoscale 等期刊的審稿人。團隊隸屬于深圳市納米生物傳感技術(shù)重點實驗室、深圳大學(xué)納米傳感與分子診療研究中心。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c01193

1. Chen, Y.; Mei, Y. X.; Zhao, X. H.; Jiang, X. Y., Reagents-Loaded, Automated Assay that Integrates Recombinase-Aided Amplification and Cas12a Nucleic Acid Detection for a Point-of-Care Test. Anal. Chem. 2020, 92, 14846-14852.

2. Chen, Y.; Zong, N.; Ye, F. D.; Mei, Y. X.; Qu, J. X.; Jiang, X. Y., Dual-CRISPR/Cas12a-Assisted RT-RAA for Ultrasensitive SARS-CoV-2 Detection on Automated Centrifugal Microfluidics. Anal. Chem. 2022, 94, 9603-9606.

3. Wang, B.; Wang, R.; Wang, D. Q.; Wu, J.; Li, J. X.; Wang, J.; Liu, H. H.; Wang, Y. M., Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-Based Platform for Rapid and Visual Nucleic Acid Detection. Anal. Chem. 2019, 91, 12156-12161.

4. Yin, K.; Ding, X.; Li, Z. Y.; Zhao, H.; Cooper, K.; Liu, C. C., Dynamic Aqueous Multiphase Reaction System for One-Pot CRISPR-Cas12a-Based Ultrasensitive and Quantitative Molecular Diagnosis. Anal. Chem. 2020, 92, 8561-8568.

5. Jain, P. K.; Ramanan, V.; Schepers, A. G.; Dalvie, N. S.; Panda, A.; Fleming, H. E.; Bhatia, S. N., Development of Light-Activated CRISPR Using Guide RNAs with Photocleavable Protectors. Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 12440?12444.

6. Moroz-Omori, E. V.; Satyapertiwi, D.; Ramel, M. C.; Hogset, H.; Sunyovszki, I. K.; Liu, Z. Q.; Wojciechowski, J. P.; Zhang, Y. Y.; Grigsby, C. L.; Brito, L.; Bugeon, L.; Dallman, M. J.; Stevens, M. M., Photoswitchable gRNAs for Spatiotemporally Controlled CRISPRCas-Based Genomic Regulation. ACS Cent. Sci. 2020, 6, 695?703.