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圖1. 光籠5'帽類似物用于光控mRNA翻譯示意圖（圖片來(lái)源：Nat. Chem.）

研究背景

信使RNA（簡(jiǎn)稱mRNA）是一種參與蛋白質(zhì)合成的單鏈RNA。mRNA的作用是將蛋白質(zhì)信息從細(xì)胞核中的DNA傳送到細(xì)胞質(zhì)，隨后讀取mRNA序列并將每個(gè)三堿基密碼子翻譯成其相應(yīng)的氨基酸。真核生物mRNA具有特定的 5'帽結(jié)構(gòu)，其通過(guò)5'-5'三磷酸橋?qū)7-甲基化鳥(niǎo)苷連接到第一個(gè)轉(zhuǎn)錄核苷酸。5'帽結(jié)構(gòu)在翻譯起始中起關(guān)鍵作用，主要?dú)w因于 N7 甲基化鳥(niǎo)苷對(duì)于翻譯起始因子eIF4E的特定識(shí)別。同時(shí)5'帽對(duì)于許多mRNA質(zhì)控起關(guān)鍵作用，并保護(hù)真核mRNA免受外切酶降解。mRNA周轉(zhuǎn)和體內(nèi)平衡需要專用的去蓋酶（Dcp1-2、DcpS）。5'帽與3'末端的poly(A)尾一起形成mRNA“閉環(huán)”，從而促進(jìn)eIF4E和poly(A)結(jié)合蛋白之間的相互作用。沒(méi)有5'帽的RNA幾乎不翻譯，并且具有高度免疫原性。因此，用于生物學(xué)研究和治療應(yīng)用的mRNA的生產(chǎn)通常涉及5'-加帽。

圖2. 真核生物mRNA翻譯啟動(dòng)過(guò)程以及化學(xué)修飾的位點(diǎn)（圖片來(lái)源：Nat. Chem.）

關(guān)鍵合成步驟

作者通過(guò)在5'端鳥(niǎo)苷N²引入光裂解基團(tuán)，其中氨基甲酸甲酯作為橋連物可在光作用下有效裂解。以鳥(niǎo)苷為起始反應(yīng)物，首先使用三甲基甲硅烷基氯化物（Me₃SiCl）保護(hù)羥基。然后在一鍋反應(yīng)中，將鳥(niǎo)苷的游離氨基轉(zhuǎn)化為異氰酸酯，通過(guò)與鄰硝基芐基 （ONB） 醇、3,4-二甲氧基- 2-硝基芐基（DMNB）醇、6-硝基胡椒基（NP）醇、6-硝基胡椒基-甲基（NPM）醇反應(yīng)，形成光可裂解基團(tuán)或紅移衍生物。之后用氨水（THF溶液）去除TMS基團(tuán)以獲得光籠鳥(niǎo)苷。然后將光籠鳥(niǎo)苷在5'-OH處單磷酸化以產(chǎn)生圖二中6a,b化合物，甲基化后形成化合物7a,b，并與鳥(niǎo)苷-5'-二磷酸咪唑啉偶聯(lián)從而得到最終產(chǎn)物。

圖3. 具有光可裂解基團(tuán)（FlashCaps）的帽類似物以及光觸發(fā)翻譯的整體合成思路（圖片來(lái)源：Nat. Chem.）

結(jié)構(gòu)及性能分析

作者進(jìn)一步分析了N²位置具有光可裂解基團(tuán)鳥(niǎo)苷的吸收光譜。ONB鳥(niǎo)苷僅在300?nm以上顯示低吸光度，DMNB鳥(niǎo)苷在350?nm處顯示最大吸收，NP和NPM鳥(niǎo)苷略微紅移，在360?nm處達(dá)到最大值。為了選擇最適合生物應(yīng)用的光可裂解基團(tuán)，作者在中性pH的水溶液中照射并分析它們的減少以及天然鳥(niǎo)苷的形成的HPLC和LC-MS譜圖。結(jié)果表明，在365?nm處，短時(shí)間照射（5-15?s）足以去除10?μL 500?μM 溶液中的光裂解基團(tuán)，釋放游離鳥(niǎo)苷。在 405?nm，NP、NPM和DMNB組在60?s后被有效去除，比ONB組更有效。在420?nm，NPM組在120?s后完全去除。因此，作者最終選擇了DMNB和NPM組進(jìn)行進(jìn)一步研究，并合成了各自的cap0類似物。生成的FlashCaps在N²位置包含DMNB或NPM基團(tuán)。它們?cè)?00 nm以上的吸收光譜和它們的解籠罩動(dòng)力學(xué)類似于各自的光籠鳥(niǎo)苷。其還還通過(guò)在細(xì)胞裂解物中孵育cap 0或FlashCaps，然后進(jìn)行HPLC分析來(lái)評(píng)估氨基甲酸酯鍵的生物穩(wěn)定性。FlashCaps在30小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出高穩(wěn)定性，表明氨基甲酸酯鍵不是裂解液降解的主要點(diǎn)。

圖4.  光可裂解基團(tuán) (FlashCaps)基本表征（圖片來(lái)源：Nat. Chem.）

隨后，作者評(píng)估了光可裂解基團(tuán)如何影響5'帽與eIF4E的相互作用。在光籠帽存在的情況下，使用微量熱泳（MST）對(duì)FlashCaps和Cy5標(biāo)記的eIF4E的結(jié)合測(cè)量發(fā)現(xiàn)沒(méi)有產(chǎn)生結(jié)合曲線。在相同條件下，光誘導(dǎo)去除光籠基后，則獲得了與帽0相似范圍內(nèi)的特征結(jié)合曲線和Kd值（0.3?μM），表明帽0有效形成。作者同時(shí)還研究了光可裂解基團(tuán)如何影響與帽修飾酶的相互作用。DcpS是一種焦磷酸酶，可在真核細(xì)胞中將帽結(jié)構(gòu)水解為m7GMP和GDP。結(jié)果表明，與eIF4E的結(jié)果相似，DcpS——一種結(jié)合但非切割的脫帽酶變體——與cap0相互作用，但不與FlashCaps相互作用。

圖5. 光可裂解基團(tuán) (FlashCaps)修飾的mRNA基本表征（圖片來(lái)源：Nat. Chem.）

總結(jié)

隨著新冠的大爆發(fā)，信使RNA（mRNA）新冠疫苗再次成為研究熱點(diǎn)，其中以Moderna和BioNTech/Pfizer為代表，它們編碼刺突蛋白可有效防止SARS-CoV-2感染。mRNA技術(shù)不僅限于疫苗接種，還可改善自身免疫性疾病以及實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的癌癥治療。然而，到目前為止，還沒(méi)有策略可以有效實(shí)現(xiàn)定時(shí)、定點(diǎn)mRNA表達(dá)，即在不改變mRNA性能的前提下控制特定組織的遞送和攝取。在本文中，研究人員開(kāi)發(fā)了一種通過(guò)光控制mRNA翻譯的技術(shù)——FlashCaps。FlashCaps作為mRNA5'帽類似物，通過(guò)裂解氨基甲酸酯鍵連接的單個(gè)光籠基基團(tuán)，導(dǎo)致快速有效地釋放天然結(jié)構(gòu)。FlashCap-mRNAs具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）僅包含一個(gè)光可切割基團(tuán)；（2）無(wú)光照時(shí)可暫停蛋白質(zhì)翻譯；（3）定時(shí)、定點(diǎn)釋放天然 cap 0（無(wú)帽結(jié)構(gòu)）-mRNA；（4）不改變mRNA自身序列；（5）不具有免疫原性。

圖6.  Andrea Rentmeister 教授（圖片來(lái)源：Muenster university）

Andrea Rentmeister教授在格拉茨大學(xué)和波恩大學(xué)獲得化學(xué)工程和化學(xué)專業(yè)博士學(xué)位，之后加入加州理工學(xué)院弗朗西斯·阿諾德實(shí)驗(yàn)室（2018年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者）進(jìn)行博士后研究。2010年成為漢堡大學(xué)生物化學(xué)初級(jí)教授。目前，她在明斯特大學(xué)擔(dān)任生物分子標(biāo)記化學(xué)教授。致力于了解mRNA翻譯機(jī)制并最終控制其特定轉(zhuǎn)錄及翻譯。開(kāi)發(fā)多種化學(xué)和化學(xué)酶促方法，對(duì)mRNA進(jìn)行分子水平上操作、分析以及控制，并將其應(yīng)用于活細(xì)胞以及體內(nèi)。

圖7. Andrea代表奧地利參加2000年夏季奧運(yùn)會(huì)參賽照片（圖片來(lái)源：Imago）

文章詳情：

Kl?cker, N., Weissenboeck, F.P., van Dülmen, M. et al. Photocaged 5′ cap analogues for optical control of mRNA translation in cells. Nat. Chem. (2022). https://doi.org/10.1038/s41557-022-00972-7

課題組網(wǎng)頁(yè)：https://www.uni-muenster.de/Cells-in-Motion/people/all/rentmeister-a.php

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