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人體雙特異性酪氨酸-磷酸化調(diào)控激酶DYRKs是進化保守的激酶家族，以對其自身的酪氨酸殘基和其他蛋白的絲氨酸/蘇氨酸位點具有激酶活性為主要特點。DYRKs屬于絲氨酸/蘇氨酸CMGC激酶家族，共有五個成員。DYRK2是DYRKs家族的主要成員之一，但其生理功能尚未被完全揭示。近期研究表明雙特異性酪氨酸磷酸化調(diào)控激酶2(DYRK2)是一個蛋白酶體調(diào)控激酶。抑制DYRK2激酶能夠顯著降低蛋白酶體活性，導(dǎo)致小鼠異種移植模型中腫瘤細(xì)胞周期進展受阻、生長減緩。

在前期研究中，雷曉光、肖俊宇課題組與合作者報道了DYRK2特異性小分子抑制，LDN192960 （PNAS 2019）。晶體結(jié)構(gòu)解析和生化研究揭示了LDN192960 選擇性抑制DYRK2的分子機制。LDN192960能夠通過抑制DYRK2的活性而降低蛋白酶體活性，從而緩解三陰性乳腺癌和多發(fā)性骨髓瘤的進展，表明靶向DYRK2有望成為治療這兩種腫瘤的有效方案。雖然LDN192960對于DYRK2有較好的選擇性和抑制性，但是它還可以抑制其他相關(guān)激酶，包括Haspin和DYRK3。

為了消除脫靶激酶的影響，該工作通過基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計，在基于吖啶的核心結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上設(shè)計、合成和評估了一系列新型吖啶類似物，并解析了11個新型小分子抑制劑與DYRK2的共晶結(jié)構(gòu)。其中化合物17(C17)表現(xiàn)突出，對DYRK2具有納摩級別的半抑制濃度(IC50)，并對其他468個人體激酶沒有明顯的活性。此外，C17還有效的抑制了細(xì)胞中DYRK2的活性。因此，C17是一種高效且極具選擇性的DYRK2抑制劑。

圖1 C17是一個高活性、高選擇性的DYRK2小分子抑制劑

為了發(fā)現(xiàn)DYRK2新的生物學(xué)功能，該工作將C17作為一個特異而有效的探針，來研究哪些蛋白或信號通路受到DYRK2調(diào)控的影響。通過使用無標(biāo)記的定量磷蛋白組學(xué)方法研究了C17處理后細(xì)胞磷酸化蛋白組的變化。在此，該研究通過對DYRK2的mRNA含量測序，尋找了一株在內(nèi)源DYRK2基因高表達的骨髓瘤細(xì)胞系(U266)進行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明，DYRK2參與復(fù)雜的磷酸化網(wǎng)絡(luò)，通過直接、間接的作用調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。在顯著下調(diào)的位點中，該工作重點關(guān)注了兩個重要的潛在底物蛋白，真核翻譯起始因子結(jié)合蛋白1(4E-BP1)和基質(zhì)相互作用分子1(STIM1)。

圖2 基于C17的定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析

4E-BP1是轉(zhuǎn)錄過程的重要調(diào)節(jié)因子，已有研究表明是DYRK2的潛在底物。該研究通過建立體外激酶活性體系，驗證了DYRK2可以直接磷酸化4E-BP1上的多個位點（包括質(zhì)譜鑒定到的位點Thr37），并且C17以劑量依賴性的方式抑制這些位點。此外，4E-BP1受多種激酶的共同調(diào)節(jié)，進一步研究表明，當(dāng)C17與AKT、MEK抑制劑聯(lián)用時，可以更高效地抑制蛋白磷酸化水平，表現(xiàn)出不同抑制劑之間的協(xié)同效應(yīng)?？傊?，通過大量的體內(nèi)外實驗驗證，結(jié)果表明4EBP1是DYRK2的直接底物，并揭示了DYRK2 抑制劑與其他激酶抑制劑聯(lián)合用于癌癥治療的潛在用途。

STIM1是已知的磷酸化蛋白，其磷酸化可以調(diào)控鈣庫操縱的鈣內(nèi)流過程(SOCE)。該研究同樣驗證了DYRK2在蛋白水平、細(xì)胞內(nèi)都可以有效的磷酸化STIM1，這些結(jié)果表明STIM1中可能存在多個DYRK2磷酸化位點。據(jù)此，該研究進一步通過質(zhì)譜鑒定到DYRK2作用STIM1的具體位點，包括U266磷酸化蛋白組分析中確定的Ser519和Ser521。為了進一步驗證DYRK2對STIM1的磷酸化修飾的功能，通過Co-IP、FRET體系驗證了DYRK2通過對STIM1的磷酸化修飾增強其與Orai1之間的結(jié)合能力，而DYRK2-D275N，STIM1-1-491以及STIM1-10M則不能，且處理C17則可以減弱STIM1和Orai1的相互作用。進一步研究證明，DYRK2磷酸化可以促進STIM1寡聚，增強與Orai1的相互作用，進而誘導(dǎo)SOCE過程。

圖4 DYRK2磷酸化STIM1并參與調(diào)控鈣庫操縱的鈣內(nèi)流過程

該研究結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)與化學(xué)生物學(xué)方法，系統(tǒng)研究和開發(fā)了一系列新型DYRK2激酶小分子抑制劑。這些研究為靶向DYRK2的藥物開發(fā)提供了實驗數(shù)據(jù)和理論參考，也更加拓展了對DYRK2生物學(xué)功能的理解，為其后續(xù)研究提供了有力的分子工具。

該工作中，北京大學(xué)魏田田博士、王玨博士、梁如琪博士以及南方科技大學(xué)陳文東博士為該論文的共同第一作者，北京大學(xué)雷曉光教授和肖俊宇研究員，以及南方科技大學(xué)田瑞軍教授為文章的共同通訊作者。北京師范大學(xué)博士研究生陳一蘭、北京大學(xué)博士研究生曾欣、杜逸飛博士、南方科技大學(xué)何岸博士、北京大學(xué)周文靜博士、浙江大學(xué)郭行教授、北京大學(xué)陳曉偉研究員、北京大學(xué)王初教授以及北京師范大學(xué)王友軍教授對該工作提供了幫助。該工作的晶體篩選在北京大學(xué)鳳凰工程蛋白質(zhì)平臺完成，晶體數(shù)據(jù)收集在上海同步輻射光源和日本KEK同步輻射光源完成。該工作主要得到國家科技部重點研發(fā)計劃-蛋白質(zhì)機器專項，國家自然科學(xué)基金委-“生物大分子動態(tài)修飾與化學(xué)干預(yù)”重大研究計劃，北京市卓越青年科學(xué)家計劃，北京分子科學(xué)國家研究中心，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心等科研基金的資助。

原文鏈接：https://elifesciences.org/articles/77696

參考資料：https://www.chem.pku.edu.cn/kyjz/141435.htm