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利用化學修飾手段對線性多肽進行結(jié)構(gòu)約束是近年多肽藥物化學領域的一個熱門課題。 其中大環(huán)化是多肽修飾最有效的手段之一， 通過對線性肽上的多個側(cè)鏈進行交聯(lián)形成多環(huán)環(huán)肽也為具有新穎拓撲結(jié)構(gòu)的生物活性分子構(gòu)建提供新思路。目前制備多環(huán)肽的策略通常是將預制好的模板分子連接到線性肽的側(cè)鏈上，這種“嫁接式”的多環(huán)化策略大多被具有高反應活性的半胱氨酸所“壟斷”。因此需要發(fā)展新的具有高靈活度和廣泛適用性的復雜多環(huán)肽合成策略（圖1a）。

圖 1. 化學選擇性修飾構(gòu)建多環(huán)環(huán)肽

2021年，陳弓課題組利用簡單的甲醛分子(a)實現(xiàn)了對賴氨酸 (Lys，K)和酪氨酸 (Tys，Y)以及賴氨酸 (Lys，K)和精氨酸 (Arg，R)之間的交聯(lián)反應，從而開發(fā)了一套簡單實用的策略用于“裝訂”天然多肽（Angew. Chem. Int. Ed. 2021, 60, 6646-6652），分別命名為KaY和KaR反應。在KaR反應中，研究人員發(fā)現(xiàn)甲醛可與胍基和氨基選擇性高效縮合生成四氫三嗪結(jié)構(gòu) (tetrahydrotriazine, THT)（圖1b）。在此基礎上，課題組對該多組分縮合反應進一步探究。

近日陳弓教授實驗室升級并拓展了KaR反應，利用胺-甲醛-胍（am-a-gu，am代指胺，gu代指胍）三組分反應實現(xiàn)了一種具有廣泛底物普適性和高靈活度的新型多環(huán)化方法。作者通過使用胍基試劑以及簡單的甲醛水溶液，在溫和的條件下便可以實現(xiàn)對未保護的多肽的“縫合”修飾，得到結(jié)構(gòu)新穎的稠合四氫三嗪環(huán)結(jié)構(gòu)（Fused-THT）的同時，還可以構(gòu)建出復雜、新奇的多環(huán)肽結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖 2 胺-甲醛-胍三組分反應構(gòu)建多環(huán)肽

在底物1中，作者在序列中引入了兩個Lys和一個Arg，以HFIP為溶劑并加入甲醛，室溫下5個小時即可高效地構(gòu)建稠合的四氫三嗪環(huán)連接結(jié)構(gòu)，并得到了一對具有區(qū)域異構(gòu)的雙環(huán)多肽（trace-2），并將這類多組分反應命名為K(2)-a-R反應，并且該反應同樣也可以在堿性的PBS緩沖液中順利進行（trace-4）。

普適性研究中，大多數(shù)極性的官能團均不會干擾該反應，如羧基(Glu)，羥基(Thr)，咪唑(His)，巰基(Cys)可以通過對序列的調(diào)整從而規(guī)避其對反應的干擾(9)。將N端甘氨基作為成環(huán)組分進行GK-a-R成環(huán)時產(chǎn)率較低（12），主要以單環(huán)產(chǎn)物（13）；而將N端換成更長的6-氨基己酸時產(chǎn)率得到明顯提升（14）。作者還可以將K(2)-a-R反應成功應用到構(gòu)建具有巢狀拓撲結(jié)構(gòu)的三環(huán)多肽（11）。

圖 3 K(2)-a-R反應

接著作者又將K(2)-a-R反應中的固定在肽鏈上的胍基部分(Arg)移除，并引入了鹽酸胍作為胍基組分，同樣實現(xiàn)了多組分縮合反應并構(gòu)建了一系列環(huán)肽分子，甲醛和胍將多肽上兩個Lys交聯(lián)起來構(gòu)建環(huán)肽的反應，作者命名為K(2)-a-gu反應（gu代指胍）。

如圖4所示，以含有兩個Lys線性肽作為模板肽鏈，加入鹽酸胍和甲醛，以TFE作為溶劑，室溫反應5 h即可高效地得到單一區(qū)域異構(gòu)體環(huán)肽產(chǎn)物16。同時該反應也可以在水和TFE的混合溶劑中進行，部分水溶性較好的底物可以在PBS緩沖溶液中順利進行。該反應可以兼容幾乎所有的氨基酸種類，并且兩個Lys間距長短對反應的影響也不是很大。各種胍的衍生物如炔基胍、芐基胍（32）、丹磺酰胍（33）以及環(huán)胍（35）也能夠高效率參與到K(2)-a-gu反應中。此外該反應也可以在固相上高效進行，避免了因液相反應中濃度過高產(chǎn)生的分子間交聯(lián)副反應的同時，也為高通量合成這類環(huán)肽分子奠定了可能。

圖 4 K(2)-a-gu反應

從環(huán)胍產(chǎn)物35中得到啟發(fā)，作者又利用甲醛、鹽酸胍對線性肽鏈上三個Lys進行關環(huán)，從而高效地得到三環(huán)稠合的三嗪環(huán)（tris-THT）結(jié)構(gòu)并“縫合”出產(chǎn)物37。作者將甲醛和胍以及多肽上三個Lys交聯(lián)起來構(gòu)建雙環(huán)肽的反應命名為K(3)-a-gu反應。

該反應同樣可以兼容各種極性氨基酸（Glu、Asn、Thr等）。此外，同樣利用內(nèi)酰胺成環(huán)的環(huán)肽，再經(jīng)過K(3)-a-gu反應從而得到具有類似鳥巢拓撲結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物48。最后作者通過一鍋法，先采用K(2)-a-gu反應得到bis-THT結(jié)構(gòu)的環(huán)肽后，再與另外一分子丁胺進行二次縮合得到雜合tris-THT結(jié)構(gòu)的環(huán)肽49。

圖 5 K(3)-a-gu反應

為展示此類反應的應用潛力，陳弓課題組同南開大學郭東升課題組進行合作，利用這類三組分反應所產(chǎn)生的bis-THT和Tris-THT親水性“帽子”嫁接到杯芳烴下緣上（51和55），從而形成具有一定大小的空腔。利用1H NMR滴定法進行鹵負離子 (F-, Cl-, Br-) 的絡合實驗發(fā)現(xiàn)，這種稠合的四氫三嗪環(huán)修飾得到的產(chǎn)物 (55) 室溫下在氘代氯仿中能夠選擇性與F-結(jié)合 (3.64 × 103 M?1) ，而未形成Tris-THT結(jié)構(gòu)的54則與F-有著較弱的結(jié)合能力 (Ka=1.60 × 102 M-1) 。

圖 6

圖 7

理論計算部分，中科院有機所的薛小松課題組通過密度泛函理論（DFT）對反應進程進行了揭示（圖7）。首先以甲醛、甲胺、胍之間的反應模擬反應體系，對反應初始的兩種可能啟動路徑進行了理論計算，結(jié)果表明， pathway II中啟動步驟在動力學上更為有利。質(zhì)子化的胍基57經(jīng)歷脫質(zhì)子化后繼續(xù)與甲醛反應生成胍的羥甲基化產(chǎn)物59，再質(zhì)子化并脫水得到胍亞胺產(chǎn)物61，此時甲胺作為親核試劑進攻胍亞胺并跨越18.7kcal/mol能壘生成第一步分子間交聯(lián)產(chǎn)物，該途徑能夠釋放足夠的能量（ΔG= -13.1 kcal / mol），為完成整個反應提供了強大的驅(qū)動力。同時作者發(fā)現(xiàn)胍與胍、胺與胺的同質(zhì)交聯(lián)（homo-crosslinking）產(chǎn)物能量均高于異質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物，這為多氨基體系中優(yōu)先選擇性地發(fā)生異質(zhì)交聯(lián)提供了理論依據(jù)。

綜上，陳弓教授課題通過對甲醛多組合交聯(lián)化學的拓寬和優(yōu)化，在之前工作的基礎上發(fā)展了升級版的am-a-gu反應從而實現(xiàn)無保護多肽的“縫合”修飾，構(gòu)建出了更加復雜、新穎且具有拓撲結(jié)構(gòu)的多環(huán)肽分子，豐富了復雜多肽的化學空間，相關工作最近發(fā)表在Journal of the American Chemical Society上 （DOI：10.1021/jacs.2c04620）。