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細(xì)胞作為生物體生命活動(dòng)的基本單元，為了不被干擾地同時(shí)進(jìn)行多種復(fù)雜的生化反應(yīng)，演化出許多膜包被的細(xì)胞器——如細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等——對異質(zhì)性的生化過程進(jìn)行區(qū)塊化的分隔，保證不同的反應(yīng)在特定的區(qū)域內(nèi)高效、有序地完成。除了膜包被的細(xì)胞器外，還存在一類無膜包被或者半膜包被的可以富集生物大分子的結(jié)構(gòu)，例如核仁、應(yīng)激顆粒（Stress granule），以及神經(jīng)元中的突觸后致密區(qū)（postsynaptic density, PSD)等1–3。近年來，這些結(jié)構(gòu)的形成原理和功能在科學(xué)界引起了極大的關(guān)注，人們發(fā)現(xiàn)這類結(jié)構(gòu)一般是通過蛋白-蛋白或蛋白-RNA相互作用形成液–液相分離（Liquid-liquid phase separation, LLPS）產(chǎn)生的。LLPS主要以不同蛋白結(jié)構(gòu)域、蛋白內(nèi)在無序區(qū)（intrinsic disordered region）以及蛋白-RNA間形成的多價(jià)相互作用為驅(qū)動(dòng)力而發(fā)生2。無膜或半膜細(xì)胞器在細(xì)胞中發(fā)揮重要的功能，相比于傳統(tǒng)的膜包被的細(xì)胞器，它們可以更高效地與外界環(huán)境發(fā)生物質(zhì)交換，同時(shí)保障結(jié)構(gòu)內(nèi)的物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)處于相對獨(dú)立的空間，其組成與濃度可以被精確調(diào)控。目前，針對LLPS在生理及病理狀態(tài)下的功能研究已取得諸多突破性成果，LLPS已被證明在基因表達(dá)調(diào)控4、細(xì)胞對外在環(huán)境的壓力響應(yīng)5、先天免疫應(yīng)答6、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生7等方面均發(fā)揮重要作用。基于這些成果，對液–液相分離過程的精準(zhǔn)時(shí)空調(diào)控及其分子機(jī)制的研究也方興未艾。

蛋白的翻譯后修飾（post-translational modifications, PTMs）可以通過改變氨基酸殘基間的相互作用強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對液-液相分離體系的動(dòng)態(tài)調(diào)控8。例如，精氨酸甲基化修飾通過減弱其與芳香氨基酸間的相互作用抑制Ddx4、hnRNPA2、FUS和FMRP等蛋白形成LLPS9–13；磷酸化修飾可以在不同的相分離體系起到截然相反的調(diào)控作用，如Tau7和FMRP14蛋白的磷酸化修飾促進(jìn)其發(fā)生LLPS，而FUS和TDP-43的LLPS過程受磷酸化修飾抑制15,16。

盡管多種翻譯后修飾已被闡明可以參與LLPS的調(diào)控，糖基化修飾——一種廣泛存在于高等生物細(xì)胞中的翻譯后修飾——對LLPS的調(diào)控作用卻始終未被系統(tǒng)研究和闡釋。O-GlcNAc修飾是存在于胞內(nèi)蛋白絲氨酸和蘇氨酸殘基上的糖基化修飾，在哺乳動(dòng)物大腦中廣泛分布，其修飾酶OGT在興奮性神經(jīng)元PSD中大量富集17,18。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心陳興課題組一直致力于解析糖基化修飾在不同器官與組織中的分布和生物學(xué)功能。他們發(fā)現(xiàn)，PSD的重要組成蛋白SynGAP具有多個(gè)O-GlcNAc修飾位點(diǎn)。此前，香港科技大學(xué)（現(xiàn)南方科技大學(xué)）的張明杰課題組發(fā)現(xiàn)，SynGAP與PSD中的腳手架蛋白PSD-95所形成的復(fù)合物可發(fā)生液-液相分離，且該LLPS過程對于PSD的形成和功能具有重要意義19,20。基于此，陳興課題組與北京大學(xué)藥學(xué)院董甦偉課題組、張明杰課題組等合作，利用化學(xué)半合成策略構(gòu)建了特定位點(diǎn)具有O-GlcNAc修飾的SynGAP蛋白，闡明了O-GlcNAc修飾對SynGAP/PSD95液–液相分離過程的調(diào)控和分子機(jī)制，相關(guān)成果以“O-GlcNAcylation modulates liquid–liquid phase separation of SynGAP/PSD-95”為題于2022年5月30日發(fā)表在Nature Chemistry雜志。

在所鑒定到的眾多O-GlcNAc修飾位點(diǎn)中，他們選定了位于SynGAP蛋白CC-PBM結(jié)構(gòu)域1159位絲氨酸（S1159）與1306位蘇氨酸（T1306）兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行深入研究，因?yàn)镃C-PBM結(jié)構(gòu)域通過與PSD-95蛋白PSG結(jié)構(gòu)域的相互作用形成LLPS（圖1a）。利用表達(dá)蛋白連接（expressed protein ligation, EPL）策略，他們合成了S1159與T1306位點(diǎn)特異O-GlcNAc修飾的SynGAP CC-PBM蛋白（SynGAP-S1159OG & SynGAP-T1306OG，圖1b）。接著，通過液滴成像實(shí)驗(yàn)與沉淀離心實(shí)驗(yàn)，證明了SynGAP-T1306OG可以完全抑制LLPS形成（圖1c）。結(jié)合同源結(jié)構(gòu)模擬與體積排阻-靜態(tài)光散射分析，他們提出SynGAP蛋白T1306位點(diǎn)的O-GlcNAc修飾通過阻礙T1306與PSD-95蛋白369位組氨酸（H369）間形成氫鍵，破壞蛋白相互作用進(jìn)而阻礙LLPS形成，并在細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證了該機(jī)理（圖1d-e）。

圖1  SynGAP蛋白O-GlcNAc位點(diǎn)鑒定，蛋白合成與抑制LLPS機(jī)理

O-GlcNAc修飾通常是亞化學(xué)計(jì)量，即修飾率不足100%。那么，亞化學(xué)計(jì)量的O-GlcNAc修飾能否有效地調(diào)控LLPS便是一個(gè)重要的問題。他們通過調(diào)整合成蛋白中O-GlcNAc修飾比例，模擬不同修飾率對LLPS的影響，結(jié)果顯示不同修飾率（10% ~ 100%）均可以對LLPS產(chǎn)生不同程度的抑制。同時(shí)，與通過降低蛋白濃度抑制LLPS的方式相比，等比例的O-GlcNAc修飾對LLPS具有更明顯的抑制效果，即O-GlcNAc對于LLPS的抑制呈現(xiàn)出顯性負(fù)調(diào)控（dominant-negative effect）的特征（圖2a-b）。此外，O-GlcNAc修飾對LLPS的抑制是動(dòng)態(tài)可逆的，通過加入O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶OGT或去修飾酶OGA可以動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)O-GlcNAc水平與LLPS閾值（圖2c）。

陳興課題組長期致力于糖化學(xué)和糖生物學(xué)研究，神經(jīng)系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)糖基鑒定與功能研究是目前的重點(diǎn)方向之一。本工作利用化學(xué)半合成策略與多種技術(shù)手段，詳細(xì)闡明了特定位點(diǎn)O-GlcNAc修飾對SynGAP/PSD-95液–液相分離的調(diào)控作用，揭示了O-GlcNAc修飾在該體系中顯性負(fù)調(diào)控的作用方式和抑制LLPS發(fā)生的分子機(jī)制，證明了OGT/OGA對該過程的動(dòng)態(tài)調(diào)控。該發(fā)現(xiàn)為詮釋O-GlcNAc修飾在調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與突觸可塑性等過程中的重要功能提供一個(gè)新的機(jī)制。同時(shí)，O-GlcNAc修飾可能作為一種普適性的調(diào)控機(jī)制，調(diào)控多種液–液相分離過程。

圖2  O-GlcNAc修飾對LLPS的顯性負(fù)調(diào)控與OGA動(dòng)態(tài)調(diào)控

北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、北大清華生命科學(xué)聯(lián)合中心的陳興教授和北京大學(xué)藥學(xué)院、天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室董甦偉教授為本論文的共同通訊作者，生命科學(xué)聯(lián)合中心已畢業(yè)博士生呂品歐、杜逸飛和北京大學(xué)藥學(xué)院已畢業(yè)博士生賀長棟為論文的共同第一作者。南方科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張明杰課題組、北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李沉簡教授和化學(xué)與分子工程學(xué)院鄒鵬課題組參與了該研究工作。該研究工作得到了國家自然科學(xué)基金委、科技部、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心和北京分子科學(xué)國家研究中心的資助。

原文連接：https://doi.org/10.1038/s41557-022-00946-9

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