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抗體藥物偶聯(lián)物（Antibody-Drug Conjugates,ADCs）通過化學連接將細胞毒素連接至抗體，利用抗體的靶向作用實現(xiàn)毒素對腫瘤的特異性殺傷。通過定點偶聯(lián)技術得到的ADC化合物相比隨機偶聯(lián)具有更好的治療指數(shù)，是目前ADC領域的研究熱點之一。

　　Fc結構域N297位是抗體保守的糖基化位點，在該位點引入細胞毒素形成的糖鏈定點ADC化合物（glycosite-specific ADCs, gsADCs）具有不影響抗原結合、穩(wěn)定性更好等優(yōu)勢，近年來受到廣泛關注。目前，已報導的糖鏈定點偶聯(lián)策略首先需要對抗體進行糖工程改造，通過糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷內(nèi)切酶在糖基化位點引入生物正交基團，進一步通過生物正交反應偶聯(lián)毒素，從而實現(xiàn)糖鏈定點ADC的制備（如圖1所示）。整個過程往往需要2-3種酶的參與，3-4步的反應，底物合成復雜且依賴于生物正交反應，阻礙了糖鏈定點ADC藥物系統(tǒng)性的構效關系研究。

　　為解決上述關鍵問題，中科院上海藥物所黃蔚課題組開發(fā)了新穎的糖鏈定點ADC制備策略。基于新穎截短型糖結構的藥物-連接子和野生型糖苷內(nèi)切酶Endo-S2，將小分子細胞毒藥物“一步”定點連接到抗體糖基化位點，實現(xiàn)糖鏈定點ADC化合物的制備。該研究成果于2021年12月24日以“One-step synthesis of site-specific antibody-drug conjugates by reprogramming IgG glycoengineering with LacNAc-based substrates”為題發(fā)表在《藥學學報》英文刊（Acta Pharmaceutica Sinica B）上。

　　研究人員首先篩選了一系列糖底物和糖苷內(nèi)切酶，發(fā)現(xiàn)野生型糖苷內(nèi)切酶Endo-S2可以將二糖底物LacNAc轉(zhuǎn)移至去糖抗體N297位糖基化位點，且LacNAc半乳糖6號位唾液酸化修飾不影響Endo-S2的轉(zhuǎn)糖基化活性（如圖2A所示）。由于Endo-S2本身是非常強的特異性水解抗體N297位點不均一N-糖鏈的水解酶，而研究發(fā)現(xiàn)其可以催化LacNAc轉(zhuǎn)移至糖基化位點，同時喪失對LacNAc修飾抗體的糖鏈水解活性。這表明Endo-S2和LacNAc的組合可以直接實現(xiàn)野生型抗體的糖基化改造，且Endo-S2對多樣化LacNAc修飾的兼容性，可以高效獲得多樣性功能修飾的巖藻糖化或去巖藻糖化的糖工程抗體（如圖2B所示），以及實現(xiàn)抗體的內(nèi)吞成像研究及糖鏈延伸等功能化研究。

　　研究人員進一步利用疊氮化修飾的LacNAc底物實現(xiàn)了抗體糖基化位點的“一步”疊氮化修飾，并通過點擊化學反應偶聯(lián)藥物-連接子BCN-Lys(PEG)24-VC-PAB-MMAE，“兩步”制備得到定點ADC化合物gsADC-1。此外，研究人員直接在LacNAc半乳糖6號位偶聯(lián)毒素MMAE，獲得LacNAc-VC-PAB-MMAE復合物，并在Endo-S2的催化下直接實現(xiàn)了MMAE連接至抗體糖基化位點，“一步”獲得了均一性的糖鏈定點ADC化合物gsADC-2。高分辨質(zhì)譜分析、疏水相互作用分析（HIC）、聚集穩(wěn)定性分析（SEC）測試顯示，上述兩種策略獲得的糖鏈定點ADC化合物具有非常好的結構均一性（drug to antibody ratio，DAR=2）、親水性和體外穩(wěn)定性，獲得的ADC化合物具有很強的體外腫瘤抑制活性。同時，在NCI-N87腫瘤模型中，相比陽性對照ADC化合物（DAR=3.5）及前期寡糖鏈定點ADC化合物（DAR=4），該策略研發(fā)的糖鏈定點ADC化合物（DAR=2）在低載藥量的情況下依然具有更強的體內(nèi)腫瘤抑制活性。上述研究體現(xiàn)了基于截短型連接子LacNAc形成的糖鏈定點ADC化合物不僅具有更好的工藝優(yōu)勢，也具有顯著的藥效優(yōu)勢。除研究使用的曲妥珠單抗外，策略同樣適用于其它治療性單抗、雙特異性抗體及Fc融合蛋白。

　　綜上所述，研究人員基于截短型糖連接子LacNAc和糖苷內(nèi)切酶Endo-S2，實現(xiàn)了野生型抗體的“一步”糖基化改造，并建立了糖鏈定點ADC化合物的“一步”制備策略。該策略克服了傳統(tǒng)“兩酶三步”糖鏈定點ADC制備策略的限制，實現(xiàn)了小分子細胞毒藥物的“一步”定點組裝，避免了對生物正交反應的依賴，同時該策略的工藝優(yōu)勢將促進糖鏈定點ADC藥物系統(tǒng)的構效關系研究，有利于推動定點ADC藥物的深入發(fā)展。

　　上海藥物所博士后施偉為本文的第一作者，上海藥物所黃蔚研究員、唐峰副研究員為本文共同通訊作者。同時，該工作還獲得上海藥物所宮麗崑研究員、李鐵海研究員及聊城大學范樹泉老師的幫助。該研究得到了國家自然基金委、上海市科技重大專項、中科院特別研究助理計劃、山東省自然科學基金等項目的資助。

全文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211383521004858

圖1. 糖鏈定點ADC化合物制備策略

圖2. 糖底物及糖苷內(nèi)切酶的篩選及抗體的多樣性糖工程改造。A，糖底物及糖苷內(nèi)切酶的篩選；B，LacNAc的衍生化及抗體的糖工程改造。

圖3. 基于LacNAc和Endo-S2的糖鏈定點ADC化合物制備。A-B，糖鏈定點ADC化合物的“一步”和“兩步”制備策略；C，疏水相互作用色譜（HIC）顯示出該策略制備的定點ADC化合物均有很好的結構均一性；D，分子排阻色潽（SEC）顯示出該策略制備的定點ADC化合物具有很好的穩(wěn)定性；E，定點ADC化合物對SK-Br-3細胞的體外抑制曲線；F，ADC化合物對NCI-N87移植瘤的體內(nèi)腫瘤抑制曲線；G，小鼠體重曲線；H，治療周期結束后腫瘤照片。

參考資料：http://www.simm.ac.cn/web/xwzx/kydt/202201/t20220113_6339903.html