膽汁酸受體TGR5(Takeda G protein-coupled receptor 5)在血糖穩(wěn)態(tài)、能量消耗和肝臟保護等方面起重要作用,是一個極具潛力的治療代謝綜合征及炎癥性疾病的藥物靶點。然而,多種已報道的TGR5激動劑在人和小鼠體內(nèi)存在較大的活性差異,利用現(xiàn)有的嚙齒類動物模型開展化合物藥效學和毒理學研究會產(chǎn)生偏差。近日,中國科學院上海藥物研究所研究團隊發(fā)現(xiàn)鼠源TGR5中的第88位組氨酸(人源TGR5中的第89位酪氨酸)是造成人鼠受體活性差異的關(guān)鍵,進而利用CRISPR-Cas9構(gòu)建了TGR5H88Y人源化小鼠模型,并利用該模型驗證了白樺脂酸類衍生物11d-Na是一個體內(nèi)體外藥理藥效優(yōu)異的TGR5激動劑。相關(guān)成果發(fā)表在J. Med. Chem.上。
膽汁酸是兩親性的類固醇,由肝臟合成后儲存于膽囊,膽汁酸除了參與食物來源脂質(zhì)消化吸收以外,也作為體內(nèi)的的信號分子,在血糖穩(wěn)態(tài),脂質(zhì)調(diào)節(jié),能量代謝等方面發(fā)揮重要的功能。膽汁酸在體內(nèi)可激活核受體FXR(farnesoid X receptor)及膜受體TGR5(Takeda G protein-coupled receptor 5)。TGR5也被稱為G蛋白膽汁酸偶聯(lián)受體1(G protein-coupled bile acid receptor 1,GPBAR1),與Gαs相偶聯(lián),廣泛表達于多種的細胞類型。TGR5的激活不僅可以直接刺激胰島β細胞分泌胰島素,也可作用于腸內(nèi)分泌細胞,通過促進GLP-1(glucagon-like peptide 1)的分泌,以間接的方式作用于胰島素的分泌,因而成為備受關(guān)注糖尿病藥物的靶點。
然而,在TGR5激動劑的開發(fā)中,許多化合物在鼠源的TGR5受體(mTGR5)上的活性和在人源的TGR5(hTGR5)上相比有顯著差異,而在犬受體(cTGR5)上的活性則與人相當。研究團隊前期發(fā)現(xiàn)白樺脂酸類化合物在各種屬TGR5上的活性差異尤為明顯,這就意味著利用現(xiàn)有的嚙齒類動物模型開展化合物藥效學和毒理學研究會產(chǎn)生偏差。為了解決這一問題,研究人員從TGR5種屬差異入手,通過比對不同種屬的TGR5序列,重點關(guān)注了在人源和犬源受體上氨基酸相同,但在鼠源受體上不同的位點,并發(fā)現(xiàn)鼠源受體中的第88位的組氨酸是一個影響其活性的關(guān)鍵位點。研究人員將該位置上的組氨酸突變?yōu)槿嗽?犬源受體中的酪氨酸之后,多類化合物尤其是白樺脂酸類衍生物在mTGR5H88Y突變體上的活性顯著提升,與hTGR5上的活性差異大大減小。隨后研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)在小鼠中引入了這一突變,構(gòu)建了TGR5H88Y人源化小鼠,這為后續(xù)藥效學研究提供了便利。
圖1 通過CRISPR-Cas9構(gòu)建TGR5H88Y人源化小鼠
同時,研究人員以白樺脂酸類TGR5激動劑XYT528B為起點,通過對C3位改造,得到了活性更優(yōu)異代謝更穩(wěn)定的氨基甲酸酯結(jié)構(gòu)3d,并且用docking解釋了活性增強的原因,即氨基甲酸酯中的羰基O和NH分別與hTGR5中Tyr240和Ser247形成氫鍵相互作用;C17羧基為活性保持所必需,任何改變都會使活性出現(xiàn)明顯下降;而對于C20位的結(jié)構(gòu)優(yōu)化,得到的活性最好的化合物11d,其在hTGR5上活性較INT777提高近20倍。
考慮到三萜類化合物固有的理化性質(zhì)缺陷,研究人員采取成鹽的方式得到溶解度和滲透性大幅提升的化合物11d-Na(hTGR5 EC50 = 6.81 ± 1.8 nM)。在TGR5H88Y人源化小鼠模型上進行的藥效學實驗中,11d-Na表現(xiàn)出良好的改善糖耐量的活性,也顯著提升了給予葡萄糖后突變鼠體內(nèi)的胰島素和GLP-1的分泌水平(在野生型小鼠模型中難以觀察到11d-Na的降糖活性)。
圖2 化合物11d-Na在體外和體內(nèi)TGR5H88Y上表現(xiàn)出更好的活性
綜上所述,此研究闡明了小鼠TGR5中第88位組氨酸(人源TGR5中第89位酪氨酸)是造成TGR5活性種屬差異的關(guān)鍵位點,通過CRISPR/Cas9將mTGR5相應(yīng)的第88位組氨酸被替換為酪氨酸,成功構(gòu)建了TGR5H88Y人源化小鼠。通過此人源化模型,研究者成功發(fā)現(xiàn)了體內(nèi)體外活性及理化性質(zhì)顯著提升的白樺脂酸衍生物11d-Na,為進一步獲得高質(zhì)量高成藥性TGR5激動劑奠定了基礎(chǔ)。
上海藥物所博士生贠盈、上海藥物所博士后張晨露以及南京中醫(yī)藥大學與上海藥物所聯(lián)合培養(yǎng)博士生郭世猛為該論文共同第一作者。南發(fā)俊研究員和謝欣研究員為共同通訊作者。該工作獲得包括國家自然科學基金委、上海市科委、中科院先導專項以及山東省自然科學基金的支持。
原文鏈接:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.1c00851
參考資料:http://www.simm.ac.cn/web/xwzx/kydt/202108/t20210824_6167398.html
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