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周期蛋白依賴性激酶(CDK)是一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有較短的N末端(β-折疊)和較長的C末端(a-螺旋)。CDK通過與相應(yīng)周期蛋白cyclin和周期蛋白依賴性激酶激活激酶(CAK)產(chǎn)生相互作用，在細(xì)胞周期的各個階段發(fā)揮作用，參與細(xì)胞的生長、分化、增殖等生理過程，介導(dǎo)細(xì)胞周期的有序進(jìn)行。CDK2是CDK家族的一員，廣泛表達(dá)于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，但其功能可被其它CDK家族成員代償，因此對于大多數(shù)正常細(xì)胞和組織CDK2是非必須的。然而，在腫瘤發(fā)生、細(xì)胞分化、減數(shù)分裂和聽力損傷修復(fù)等過程中CDK2卻發(fā)揮著重要功能，近年來的研究發(fā)現(xiàn)CDK2敲降可誘導(dǎo)AML細(xì)胞產(chǎn)生分化。然而，傳統(tǒng)的小分子抑制劑難以實現(xiàn)選擇性的CDK2抑制，也不能消除CDK2的非酶活功能，藥效不足且副作用嚴(yán)重?；蚓庉嫾夹g(shù)則在應(yīng)用效率和臨床使用中存在諸多不足。雖然認(rèn)為CDK2是良好的藥靶，但現(xiàn)有工具難以對其實現(xiàn)高效的選擇性調(diào)控。

PROTAC技術(shù)是一種利用小分子誘導(dǎo)靶蛋白泛素化，利用泛素化蛋白酶體途徑實現(xiàn)靶向蛋白敲降的技術(shù)。PROTAC由靶蛋白配體、E3泛素連接酶配體和連接鏈Linker構(gòu)成(圖1)。該小分子可誘導(dǎo)該靶蛋白與E3泛素連接酶相互作用，從而實現(xiàn)靶蛋白的非天然泛素化，被泛素化的靶蛋白進(jìn)一步被蛋白酶體識別而降解。PROTAC技術(shù)實現(xiàn)的降解不僅依賴于小分子的親和力，也需要靶蛋白和E3泛素連接酶在空間上的特異性相互作用。因此，在合理設(shè)計和充分優(yōu)化的條件下，PROTAC技術(shù)與傳統(tǒng)小分子抑制劑相比較在理論上可實現(xiàn)更好的選擇性。目前高選擇性CDK2敲降PROTAC分子還未有文獻(xiàn)報道。

圖1. PROTAC技術(shù)的原理

如何實現(xiàn)CDK2的選擇性敲降是這篇工作中作者解決的核心技術(shù)問題。親和力水平是PROTAC發(fā)揮功能的基礎(chǔ)，為保持與CDK2蛋白的親和力，研究者對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了充分的模擬，與CDK2存在重要相互作用的結(jié)構(gòu)單元需保留而暴露于溶劑區(qū)的位點則用于Linker延伸，這樣的設(shè)計可最大程度的保留與CDK2的親和力水平，而降低與非靶向蛋白的親和力。歷經(jīng)多輪迭代設(shè)計與分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化，最終基于篩選出的配體，成功發(fā)展出以J2為配體的CDK2選擇性降解劑CPS2(圖2)。

圖2.CDK2降解劑的設(shè)計、優(yōu)化和活性

研究者開發(fā)的這類新型CDK2降解劑有以下特點。適用范圍廣：在這篇工作中，作者嘗試測試了10余種細(xì)胞系，CPS2均可在納摩爾濃度下實現(xiàn)對CDK2有效敲降。選擇性佳：較小分子抑制劑，CPS2的選擇性有顯著提升。作者運用了激酶組學(xué)、激酶活性測試、蛋白質(zhì)組學(xué)和western blot等試驗，證明了當(dāng)使用CPS2處理細(xì)胞時，在可觀測的蛋白范圍內(nèi)，CDK2的降解最為顯著，而對其它蛋白沒有顯著影響(圖3)。

圖3. CPS2在多種細(xì)胞系內(nèi)誘導(dǎo)CDK2的高效選擇性降解

CPS2解決了CDK2抑制劑選擇性的問題，對正常細(xì)胞(Beas2b、293T細(xì)胞系)的毒性較小，但CPS2可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖的方式產(chǎn)生抗腫瘤效果(圖4)。作者也進(jìn)行了在動物體內(nèi)急毒實驗，結(jié)果表明CPS2的安全性遠(yuǎn)高于其母核抑制劑J2(圖5)。

圖4. CPS2對正常細(xì)胞影響較小，但可阻滯腫瘤細(xì)胞快速增殖

圖5. CPS2的體內(nèi)安全性較高

研究者將CPS2進(jìn)一步應(yīng)用于AML分化治療中。在CPS2處理下，AML細(xì)胞的分化指標(biāo)顯著升高，細(xì)胞形態(tài)更成熟(圖6)。同時，作者進(jìn)行了多組Rescue實驗，證明了CPS2通過引起細(xì)胞內(nèi)CDK2的降解執(zhí)行分化誘導(dǎo)功能。為充分論證CPS2作為CDK2選擇性降解劑在AML臨床治療上的重要意義，研究者采集了多株AML病人原代細(xì)胞，并加入CPS2進(jìn)行處理。結(jié)果表明，原代細(xì)胞在藥物的處理下也可產(chǎn)生明顯分化，充分證明了CPS2的潛在臨床應(yīng)用意義。

圖6. CPS2處理下，AML細(xì)胞產(chǎn)生明顯分化

圖7. CPS2的功能特色

在該工作中，研究者開發(fā)了一類CDK2選擇性降解劑，并初步研究了該分子的安全性和有效性。研究者將這項新的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于AML分化治療領(lǐng)域，為AML治療提供了一種潛在的高效、低毒的新型治療方案(圖7)。除AML治療外，該類降解劑或可在CDK2相關(guān)的其它疾病治療領(lǐng)域也發(fā)揮重要功能。
清華大學(xué)博士生王立國、浙江大學(xué)博士后邵雪晶、清華大學(xué)博士生鐘天白、清華大學(xué)博士生吳越和浙江大學(xué)博士生許愛笑為該工作共同第一作者，清華大學(xué) 饒燏教授和浙江大學(xué)應(yīng)美丹教授為共同通訊作者。該研究得到了清華大學(xué)吳畏教授、陶慶華教授、李海濤教授、中國科學(xué)院北京基因組研究所王前飛教授的大力幫助。該研究得到了中國國家自然科學(xué)基金會、國家重大科技專項“重大新藥開發(fā)”和國家重點研發(fā)計劃的大力支持。

參考資料

[1] 最新研究成果 | 清華大學(xué)饒燏團隊與浙江大學(xué)應(yīng)美丹團隊在《Nature Chemical Biology》發(fā)表CDK2降解劑的設(shè)計及在AML分化治療中的應(yīng)用研究http://www.sps.tsinghua.edu.cn/cn/news/achievement/2021/0305/718.html

[2] 論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41589-021-00742-5