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羅丹明衍生物和類似物已廣泛用于不同的超分辨率成像技術，尤其是光活化定位顯微技術（PALM）。這些羅丹明衍生物和類似物中，羅丹明螺內(nèi)酰胺因為在光變色轉(zhuǎn)換過程中具有理想的光暗對比度，所以在PALM成像方面表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。雖然研究者早就開始對羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺進行修飾，但是幾乎沒有人考慮到PALM成像的一個重要特征——光變色轉(zhuǎn)換工作時間。在PALM成像中，空間分辨率和時間分辨率之間總是不能同時滿足。

圖1. a)常見羅丹明螺環(huán)內(nèi)酯的光致變色機理，如Rh-PHT和Rh-MGly；b) 鋅離子型羅丹明螺內(nèi)酯的光致變色機理；c)肖義教授團隊光致變色機理，Rh-Gly（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

為了更好地理解酸度對螺環(huán)內(nèi)酰胺或兩性離子存在的影響，作者測定了Rh-Gly和類似物Rh-MGly在相同條件下的pKa。結果表明，Rh-Gly轉(zhuǎn)化為相應的兩性離子不需要強酸性條件，并且兩性離子可以通過“自穩(wěn)定”結構在一定程度上得到穩(wěn)定。這種穩(wěn)定延長了兩性離子的壽命，有助于提高Rh-Gly的光激活效率。

 圖2. a) 羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺的自發(fā)環(huán)化平衡；b,c) Rh-Gly發(fā)射光譜和pH的關系（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

因為羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺在中性介質(zhì)中不斷自發(fā)開環(huán)，Rh-Gly的弱酸性pKa保證了其大部分熒光團在生理條件下以非熒光螺環(huán)內(nèi)酰胺的形式存在，從而避免了活細胞PALM成像過程中信號重疊。

作者還對Rh-Gly的光激活條件和單分子熒光工作時間進行了研究。與類似物Rh-MGly和早前報道的PALM染料Rh-Pht相比，Rh-Gly在單分子水平上延長工作時間表現(xiàn)出可重復性和紫外激活可控性。羧基對兩性離子的穩(wěn)定作用不僅增加了總光子的聚集，而且提高了單分子的亮度。

圖3. Rh-Gly的光活化、單分子熒光的實時測量及與類似物的比較（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

  緊接著，作者研究了Rh-Gly對活細胞線粒體的PALM成像情況。研究結果表明：Rh-Gly在不同的細胞系(HeLa和MCF-7)中也顯示出一種特殊的線粒體染色特性。由于工作時間的延長，Rh-Gly的活細胞線粒體PALM成像的瞬時分辨率被縮短到10秒的同時，還保留了大約25 nm的定位精度。空間分辨率和時間分辨率之間的平衡使得Rh-Gly可以用于獲得更多活細胞線粒體的高質(zhì)量超分辨率圖像。此外延長的工作時間使得Rh-Gly具有獲得更寬廣的單分子運動軌跡的潛力。

圖4. Rh-Gly的雙色共域分析（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖5.在活體HeLa中線粒體富集區(qū)的超分辨率成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

作者還分別使用HaloTag配體衍生物和異硫氰酸酯衍生物（NCS）修飾Rh-Gly，使得Rh-Gly可以標記特殊細胞。通過自標記蛋白標簽，HaloTag配體修飾的Rh-Gly可以用于histone H₂B蛋白在活的HeLa細胞中的超分辨率成像；通過免疫染色抗體標記法，異硫氰酸酯（NCS）修飾的Rh-Gly可以在被固定的細胞中實現(xiàn)微管的超分辨率成像。

圖6. 組蛋白的超分辨率成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖7. 微管超分辨率成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結：不同于以往利用羅丹明染料的螺環(huán)對pH，RNS/ROS等響應，大連理工大學肖義教授團隊設計了一種新的羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺染料Rh-Gly解決PALM成像中工作時間問題，發(fā)展了一種簡單而有效的延長光致變色羅丹明螺內(nèi)酰胺工作時間的策略，有利于PALM成像。通過在靠近內(nèi)酰胺的位置引入一個羧基，發(fā)揮內(nèi)酸性作用，穩(wěn)定了光產(chǎn)生的兩性離子。Rh-Gly在單分子水平上表現(xiàn)出可重復和紫外可控的激活能力，延長了兩性離子的時間。羧基對兩性離子的穩(wěn)定作用不僅增加了總光子的收集量，而且提高了單分子的亮度。此外，Rh-Gly在不同的細胞系(HeLa和MCF-7)中也有特異性的線粒體染色。隨著時間的延長，活細胞線粒體PALM成像的時間分辨率縮短到10 s，定位精度保持在25 nm左右。由于時空分辨率的平衡，Rh-Gly進一步獲得了活細胞線粒體的一系列超分辨率圖像。HaloTag配體衍生物和異硫氰酸酯衍生物擴展了Rh-Gly對特定細胞標記的功能；通過自標記蛋白標記和免疫染色方法，這些衍生物能夠?qū)?/span>HeLa細胞中的組蛋白和微管進行高分辨率成像。因此，肖義教授團隊的工作為今后羅丹明螺環(huán)內(nèi)酰胺的開發(fā)提供了一條新的途徑。

撰稿人：犟子柳