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帶有胍基側(cè)鏈的精氨酸，作為蛋白質(zhì)中一種關(guān)鍵的基本氨基酸，在酶催化、大分子相互作用、能量代謝及免疫調(diào)節(jié)等生命過程中都發(fā)揮著不可替代的重要作用。然而，相較于半胱氨酸、賴氨酸等其它親核氨基酸，精氨酸的化學反應性較低，難以實現(xiàn)對其高選擇性的共價標記。盡管已有一些化學探針被開發(fā)用于精氨酸標記，但其在復雜的蛋白質(zhì)組環(huán)境中進行全局性、定量分析的能力仍然有限，這導致在系統(tǒng)研究精氨酸在蛋白質(zhì)發(fā)揮功能中的作用時面臨著巨大挑戰(zhàn)。

北京大學化學與分子工程學院，北大-清華生命聯(lián)合中心雷曉光教授領(lǐng)銜的科研團隊長期致力于開發(fā)新一代高效的生物相容反應，通過化學探針或化學交聯(lián)劑結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)的功能及結(jié)構(gòu)（JACS 2013, 135, 4996; Elife 2016, 5, e12509; Anal. Chem. 2018, 90, 1195; Nat. Commun. 2019, 10, 3911; Nat. Commun. 2022, 13, 1468）。

近日，該研究團隊在《德國應用化學》（Angew. Chem. Int. Ed.）雜志上在線發(fā)表了題為：“Quantitative Reactivity Profiling of Functional Arginine Residues in Human Cancer Cell Line Proteomes”的研究論文（圖1），首次開發(fā)了一種基于特定精氨酸標記探針的化學蛋白質(zhì)組分析方法，成功繪制了人類癌細胞中精氨酸反應性的全景圖譜。該研究不僅介紹了一種可以大規(guī)模對蛋白質(zhì)組中精氨酸殘基進行反應性分析的方法，還揭示了多個此前未報道的功能性精氨酸位點，為癌癥靶向治療提供了全新思路。

（圖1）論文截圖

在這項研究中，作者使用帶有苯基乙二醛的化學探針，結(jié)合同位素標簽串聯(lián)正交酶切的ABPP技術(shù)（isoTOP-ABPP），成功將該技術(shù)的應用范圍擴展至功能性精氨酸的系統(tǒng)性全局分析，在四個腫瘤細胞系中實現(xiàn)了對近17,000個精氨酸的反應性定量分析。為進一步驗證分析結(jié)果，團隊開展了酶活測定、哺乳動物細胞雙雜交、等溫量熱滴定等一系列實驗，最終確認了一批在酶催化和大分子相互作用中，參與功能調(diào)控的重要功能性精氨酸（圖2）。

（圖2）通過isoTOP-ABPP方法定量精氨酸反應性并識別功能性精氨酸

研究團隊使用帶有炔基的苯基乙二醛探針AP-1，在四種人類癌細胞系（MDA-MB-231、HepG2、Caco-2、HeLa）中系統(tǒng)性地分析了精氨酸的反應性，獲得了涵蓋大量蛋白質(zhì)位點的定量數(shù)據(jù)集。通過比較不同濃度探針標記后的同位素比例（R值）來確定氨基酸反應性的高低。通過酶活測定、哺乳動物細胞雙雜交和等溫量熱滴定等驗證手段，團隊從識別出的高反應活性氨基酸中成功鑒定出多個對酶的催化活性、蛋白-蛋白相互作用、蛋白-核酸相互作用具有重要貢獻的精氨酸殘基。在這些氨基酸上進行單點突變即可削弱酶的催化活性或大分子間的相互作用。這其中，乳酸脫氫酶LDHA的R171、LDHB的R172、丙酮酸激酶PKM的R43、肌酸激酶CKB的R341、真核起始因子EIF4A1的R168以及遠上游元件結(jié)合蛋白FUBP1的R118是新識別出的功能精氨酸位點，此前未被報道。研究團隊針對CKB的R341進行了更為深入的細胞生物學探索，發(fā)現(xiàn)CKB的R341突變可通過抑制CKB活性阻礙肌酸與磷酸肌酸之間的轉(zhuǎn)化，顯著抑制腫瘤細胞的增殖與遷移能力。這些結(jié)果共同證明了這項研究開發(fā)的isoTOP-ABPP蛋白質(zhì)組學方法在精確識別功能性精氨酸殘基方面的強大能力與可行性。基于對LDHA上高反應性精氨酸位點的深入理解，研究團隊進一步設(shè)計并合成了靶向LDHA的共價抑制劑ArGO-LDHA-1，該分子表現(xiàn)出對LDHA的強效、不可逆抑制（圖3），為開發(fā)針對精氨酸的共價抑制劑設(shè)計提供了新思路。

（圖3）共價抑制劑ArGO-LDHA-1對LDHA具有強效、持久、不可逆的抑制活性

總體而言，這項研究通過對四種癌細胞系進行蛋白質(zhì)組學分析，成功篩選出390個含有高反應性精氨酸的蛋白質(zhì)，系統(tǒng)闡釋了功能性精氨酸在多種蛋白發(fā)揮功能中起到的調(diào)控機制，極大深化了對其在腫瘤發(fā)生中多功能角色的理解，填補了親核氨基酸化學蛋白質(zhì)組學研究中的空白。這項工作不僅高效全面繪制出腫瘤細胞蛋白質(zhì)組范圍內(nèi)的精氨酸反應性圖譜，深化了對精氨酸功能多樣性的理解，更精準鑒定出可靶向的功能性精氨酸位點，有力推動了針對此前被視為“不可成藥”蛋白質(zhì)的共價抑制劑研發(fā)，在基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化領(lǐng)域均具有重要科學意義和廣闊應用前景。