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2025年8月19日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心雷曉光團(tuán)隊(duì)與美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校的K. N. Houk 團(tuán)隊(duì)在《PNAS》上在線發(fā)表研究論文，題為："Aspartic acid residues in BBE-like enzymes from Morus alba promote a function shift from oxidative cyclization to dehydrogenation"。該工作對(duì)白桑（Morus alba）中類BBE酶催化的氧化環(huán)化與脫氫反應(yīng)的催化機(jī)制以及選擇性進(jìn)行了探究，證實(shí)了類BBE酶中的一個(gè)天冬氨酸殘基可以作為催化堿通過(guò)去質(zhì)子化促進(jìn)二烯產(chǎn)物的產(chǎn)生；而缺失該殘基則會(huì)導(dǎo)致氧化環(huán)化發(fā)生。

在實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，雷曉光課題組發(fā)現(xiàn)了桑科植物中類BBE酶具有催化氧化脫氫、氧化環(huán)化以及分子間Diels-Alder反應(yīng)的活性，并且解析了白桑中分子間Diels-Alder反應(yīng)酶的自然演化歷程（Nat. Chem. 2020, 12, 620; Nat. Catal. 2021, 4, 1059; Nat. Commun. 2024, 15, 2492; Acc. Chem. Res.2024, 57, 2166）。在這些類BBE酶中存在一些功能雜泛性酶，它們能夠同時(shí)催化氧化脫氫以及氧化環(huán)化反應(yīng)的，比如MaDS1和MaDS6。這種功能雜泛性在類BBE酶中并不常見(jiàn)，氧化脫氫酶與氧化環(huán)化酶精確調(diào)控不同氧化路徑的分子機(jī)制仍不清楚。

在本研究中，作者首先分別解析了MaDS1-FAD（圖1A&B）以及MaDS1-FAD-氧化脫氫產(chǎn)物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，并在復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上用底物moracinC進(jìn)行分子對(duì)接（圖1C），并根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行了丙氨酸掃描突變?cè)囼?yàn)。結(jié)果表明Y116能夠與底物的酚羥基形成氫鍵相互作用，對(duì)于底物識(shí)別非常關(guān)鍵；而D175/R314/D410能夠形成氫鍵相互作用網(wǎng)絡(luò)輔助氧化脫氫反應(yīng)的發(fā)生，其中D175對(duì)于氧化脫氫反應(yīng)活性極為重要（圖1D&E）。

圖1.MaDS1晶體結(jié)構(gòu)及基于結(jié)構(gòu)的突變研究

隨后，通過(guò)同源序列比對(duì)，作者發(fā)現(xiàn)Y116在所有氧化酶中都是保守的，而D175和R314則在氧化脫氫酶中保守，在單功能氧化環(huán)化酶中對(duì)應(yīng)D175的氨基酸則為較為疏水的L或者V，對(duì)應(yīng)R314的氨基酸則為S，這也能夠表明D175和R314可能存在著共進(jìn)化的關(guān)系（圖2A）。在晶體結(jié)構(gòu)中，D175距離氧化脫氫中所需要被去質(zhì)子化的甲基距離較近，因此作者推斷該氨基酸可能作為催化堿對(duì)底物進(jìn)行去質(zhì)子化，因而將該天冬氨酸突變?yōu)樘於０坊蛘吖劝彼?，結(jié)果表明D175E突變體仍具有氧化脫氫的活性，說(shuō)明D175的羧酸基團(tuán)對(duì)于氧化脫氫活性至關(guān)重要（圖2B）。另外，在其他單功能氧化脫氫酶上講該天冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)變?yōu)閱喂δ艿难趸h(huán)化酶，而在單功能氧化環(huán)化酶的該位置引入天冬氨酸基團(tuán)也可以使其獲得氧化脫氫的活性。該結(jié)果證實(shí)了這一位點(diǎn)取代在氧化環(huán)化酶（OCs）向脫芳構(gòu)化酶（DSs）進(jìn)化過(guò)程中的關(guān)鍵作用。綜合上述發(fā)現(xiàn)，我們證實(shí)了D175位羧基對(duì)促進(jìn)白桑（M. alba）BBE類酶催化氧化脫氫反應(yīng)的重要功能（圖2C）。

圖2.D175是對(duì)于氧化環(huán)化反應(yīng)至關(guān)重要的氨基酸殘基

最后，作者密度泛函理論（DFT）計(jì)算以深入探究氧化反應(yīng)的分子機(jī)制：該反應(yīng)首先發(fā)生底物向FAD的負(fù)氫轉(zhuǎn)移，形成烯丙基碳正離子中間體，隨后在有無(wú)D175的參與的情況下有兩條反應(yīng)路徑。沒(méi)有D175參與的情況下，中間體去質(zhì)子化形成醌式中間體，該中間體隨后可以發(fā)生一步在空腔外自發(fā)的6π電環(huán)化反應(yīng)得到氧化環(huán)化的產(chǎn)物（能壘22.0 kcal/mol），分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬也表明該中間體無(wú)法在酶口袋內(nèi)穩(wěn)定存在，印證了這一結(jié)論；而另一條路徑則是通過(guò)D175對(duì)于碳正離子中間體去質(zhì)子化，隨后形成了氧化脫氫產(chǎn)物（能壘22.3 kcal/mol）。該計(jì)算結(jié)果解釋了MaDS1對(duì)氧化環(huán)化的選擇性高于氧化脫氫（圖3）。

圖3.MaDS1催化氧化環(huán)化及氧化脫氫反應(yīng)的DFT計(jì)算

北京大學(xué)雷曉光課題組博士研究生郭念昕和南京理工大學(xué)的博士研究生顧軍為本文的共同第一作者，北京大學(xué)雷曉光教授，加州大學(xué)洛杉磯分校K. N. Houk教授和原北京大學(xué)雷曉光團(tuán)隊(duì)副研究員，現(xiàn)武漢大學(xué)高磊教授為論文的共同通訊作者。該工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、The National Science Foundation of the US、北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、新基石基金會(huì)等項(xiàng)目或單位的資助。