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（圖片來源：Science）

C(sp³)-N鍵廣泛存在于生物活性分子、藥物和功能材料中，因此C(sp³)-N鍵的構(gòu)建是有機合成中不可或缺的合成過程。在過去十年中，銅催化自由基C(sp³)-N偶聯(lián)成為該領域的主導合成策略。與此同時，生物催化C(sp³)-N鍵構(gòu)建技術(shù)在過去20年快速發(fā)展，通過對轉(zhuǎn)氨酶、亞胺還原酶等的改造，以及將非天然反應機制引入酶體系，實現(xiàn)了諸如立體選擇性C(sp³)-H鍵胺化、烯烴氫胺化等挑戰(zhàn)性反應。將銅催化自由基偶聯(lián)與生物催化相結(jié)合，可兼具酶的選擇性與銅催化的反應性，為傳統(tǒng)方法難以實現(xiàn)的催化胺化反應提供新思路。其中，脫羧胺化因其能將豐富羧酸轉(zhuǎn)化為胺類而極具價值。盡管銅催化體系已取得一定的進展，但實現(xiàn)對映收斂的脫羧C(sp³)-N偶聯(lián)仍存在很大挑戰(zhàn)。最近，美國約翰霍普金斯大學Xiongyi Huang，浙江工業(yè)大學楊云芳以及美國猶他州立大學Yi Rao課題組合作開發(fā)了光生物催化新方法，利用銅取代的非血紅素酶的手性環(huán)境以及定向進化技術(shù)，高對映選擇性的實現(xiàn)了芐位C(sp³)-N自由基偶聯(lián)（Fig. 1）。歡迎下載化學加APP到手機桌面，合成化學產(chǎn)業(yè)資源聚合服務平臺。

（圖片來源：Science）

基于上述理論基礎，作者首先構(gòu)建了非血紅素酶庫進行初篩。通過模擬評估多種非血紅素酶活性位點對苯胺和模型底物NHPI酯1a的容納潛力，從中篩選出8種具有適宜活性位點環(huán)境的酶。以NHPI酯1a為底物、苯胺2b為胺偶聯(lián)配偶體、羅丹明B為光催化劑，在過量Cu(II)存在下進行脫羧胺化測試。結(jié)果顯示，僅苯丙氨酸羥化酶（CvPAH）表現(xiàn)出初始活性，能以1.1%產(chǎn)率和10%對映體過量（ee）生成目標產(chǎn)物。進一步評估發(fā)現(xiàn)，N-甲基苯胺2a的活性優(yōu)于苯胺2b（產(chǎn)率1.5%，ee值16%），而烷基胺、酰胺及磺酰胺類均無反應活性。對照實驗表明，去除酶催化劑或用牛血清白蛋白（BSA）替代CvPAH時僅得到外消旋產(chǎn)物；鐵、鈷、鎳等金屬僅產(chǎn)生痕量產(chǎn)物，凸顯出銅在該轉(zhuǎn)化中的不可替代性。

在獲得初始活性后，作者們通過定向進化改造CvPAH。該酶屬于蝶呤依賴型芳香族氨基酸羥化酶家族（AAAHs），其活性位點包含四氫生物蝶呤（BH₄）輔因子結(jié)合域和柔性底物結(jié)合環(huán)（Fig. 2A）。結(jié)合CvPAH與銅-N-甲基苯胺復合物的分子動力學模擬，作者選擇20個活性位點殘基進行飽和突變（SSM）篩選。采用GC-MS初篩結(jié)合手性HPLC立體選擇性驗證的策略，優(yōu)先保留ee值提升的突變體。在進化工程啟動前，實驗室已有突變體庫篩選獲得F107L/Y130P雙突變體，其ee值提升至66%。以此為母本進行多輪SSM篩選，最終獲得五重突變體CvPAH F107L/Y130S/W180A/P134L/Y179W（簡稱CvPAH-胺化酶），能以19%產(chǎn)率和94% ee值生成產(chǎn)物3a（Fig. 2B）。分子模擬顯示，突變導致活性腔體積擴大1.4倍，形成單一擴增空腔更利于底物1a的容納（Fig. 2C）。

（圖片來源：Science）

在獲得最終變體后，作者通過優(yōu)化反應參數(shù)提高了產(chǎn)率。質(zhì)譜分析表明，80%的NHPI酯1a通過氧化還原活化消耗，但僅16%轉(zhuǎn)化為目標胺化產(chǎn)物。系統(tǒng)優(yōu)化顯示羅丹明B是最佳光催化劑，銅離子濃度過高會降低蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。最終確立的最優(yōu)條件為：1.25 mM硫酸銅、5.0 mM抗壞血酸、10 mM N-甲基苯胺、45 mM NHPI酯1a和100 μM羅丹明B，使用OD₆₀₀ = 50的全細胞裂解液時，在4 ^oC下反應6-24小時，產(chǎn)物3a收率達92%，對映選擇性為94% ee。對照實驗證實CvPAH酶的關(guān)鍵作用，且粗酶液效果優(yōu)于純化蛋白。

底物拓展研究表明，NHPI酯芳環(huán)上的取代基顯著影響反應效率（Fig. 3）：對位異丁基導致產(chǎn)率和對映選擇性下降（3f），芐位修飾產(chǎn)生明顯差異（3g-3i），非芐基羧酸衍生物無反應活性（1b）。以1a為模型底物時，苯胺類胺化偶聯(lián)部分的耐受性較好（產(chǎn)率 > 40%，ee > 90%），但芐胺會完全抑制反應并生成酰胺副產(chǎn)物5。該策略還可兼容四氯-N-羥基鄰苯二甲酰亞胺酯9（產(chǎn)率60%，ee 90%）和Katritzky鹽等自由基前體。此外，肟酯6則產(chǎn)生開環(huán)胺化產(chǎn)物7（產(chǎn)率5.1%，ee 42%）。雖然烷基胺適用性有限，但這些發(fā)現(xiàn)證明了CvPAH平臺與多種自由基生成策略結(jié)合的潛力（Fig. 3）。

（圖片來源：Science）

最后，作者通過一系列實驗深入探究了這種光生物催化脫羧胺化反應的機理（Fig. 4）。研究發(fā)現(xiàn)，無論是外消旋還是手性NHPI底物，酶都能將其有效轉(zhuǎn)化為非手性底物構(gòu)建C-N鍵，且產(chǎn)物對映體過量始終保持在94% ee。自由基捕獲實驗和環(huán)丙基自由基鐘底物實驗證實了碳中心自由基的參與。熒光光譜分析表明，光激發(fā)態(tài)RhB*與抗壞血酸鹽（AH^?）之間最可能發(fā)生初始單電子轉(zhuǎn)移，生成的RhB^??進一步將CvPAH中的Cu(II)還原為Cu(I)。色氨酸熒光淬滅實驗顯示CvPAH-胺化酶對Cu²⁺的結(jié)合親和力（K_d = 2.52 μM）弱于野生型（K_d  = 0.48 μM），且對6-生物蝶呤的結(jié)合能力也降低。關(guān)鍵突變研究表明，179位和180位殘基對維持酶活性和立體選擇性具有協(xié)同作用，且W179A突變使產(chǎn)率從92%降至8%，ee值從94%降至10%；而A179/W180雙突變則幾乎完全喪失酶活性。這些發(fā)現(xiàn)為理解該光酶催化體系的反應機制提供了重要依據(jù)，但關(guān)于自由基生成位點等具體機制仍需通過瞬態(tài)吸收光譜等進一步研究闡明。

（圖片來源：Science）

Xiongyi Huang，楊云芳和Yi Rao課題組提出了一種脫羧形成C?N鍵的生物催化新策略，證實了多環(huán)芳烴羥化酶（PAHs）可作為對映選擇性自由基C?N成鍵的強大催化平臺。首次實現(xiàn)了酶催化的自由基C(sp³)?N偶聯(lián)反應，填補了生物催化與合成催化之間的空白。通過將該金屬酶平臺與不同自由基生成機制相結(jié)合，有望實現(xiàn)多種自然界尚未發(fā)現(xiàn)的生物催化胺化反應。