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盡管CaM在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中扮演著核心角色，但捕捉單分子CaM的瞬時構(gòu)象變化，尤其其C末端結(jié)構(gòu)域的變化，目前仍是挑戰(zhàn)。針對這一挑戰(zhàn)，南京大學(xué)陳子軒副教授研究團隊開發(fā)了一種超快速的機械響應(yīng)策略，該策略利用高速旋轉(zhuǎn)的納米陀螺（NSTs）作為納米探針，直接追蹤單個鈣調(diào)蛋白分子的構(gòu)象變化動力學(xué)。

如圖1，通過控制CaM和金棒孵育的濃度在金納米棒上設(shè)計了一個單分子CaM凸起。在溶劑分子熱運動的驅(qū)動下，納米陀螺圍繞固定在基底上的單分子凸起進行高速旋轉(zhuǎn)。利用高速相機可對NSTs的高速旋轉(zhuǎn)進行動態(tài)追蹤。

圖1：NSTs的高速旋轉(zhuǎn)示意圖

金棒的轉(zhuǎn)速主要由界面的疏水作用決定。裸金棒(AuNRs)，扁平CaM修飾的金棒(TPNRs)和含有CaM凸起的NSTs由于親疏水性的差別，在疏水基底上旋轉(zhuǎn)的速度不同(圖2)。其中，AuNRs無法旋轉(zhuǎn)，TPNRs低速旋轉(zhuǎn)，NSTs則進行高速旋轉(zhuǎn)，且單顆粒旋轉(zhuǎn)速度的分布符合對數(shù)正態(tài)分布。

圖2：AuNRs，TPNRs和NSTs的轉(zhuǎn)速差異比較

作者對影響NSTs高速旋轉(zhuǎn)的各個因素進行了研究(圖3)，包括有無單分子凸起，基底的親疏水性，溶液的粘度，溫度。

圖3：影響NSTs高速旋轉(zhuǎn)的各個因素

分子對接模擬表明，金棒上的單分子CaM的N端為接觸位點，C端暴露在外發(fā)生構(gòu)象變化。由于CaM在無鈣狀態(tài)（apo-CaM）和鈣結(jié)合狀態(tài)（Ca-CaM）下具有不同的親水和疏水特性，在疏水基底上，加入Ca²⁺后NSTs由于變得疏水就停止了旋轉(zhuǎn)，去除Ca²⁺后又恢復(fù)了旋轉(zhuǎn)(圖4)。將疏水基底更換為親水基底，加入Ca²⁺后NSTs轉(zhuǎn)速上升，進一步證實了鈣調(diào)蛋白發(fā)生了構(gòu)象變化。

圖4：單分子CaM可逆構(gòu)象變化的探測

研究表明，不同的單分子CaM對Ca²⁺的親和力具有差異，表現(xiàn)為在不同的Ca²⁺濃度下，CaM發(fā)生構(gòu)象變化的概率不同(圖5)。Mg²⁺對CaM的親和力要遠小于Ca^2+，Na+對CaM沒有親和力。通過Hill方程，作者計算了Ca²⁺和Mg²⁺下CaM的解離系數(shù)(Ca²⁺: 32μM，Mg²⁺:311μM)和Hill系數(shù)(Ca²⁺: 1.81，Mg²⁺:1.25)。

圖5：單分子CaM對離子濃度的響應(yīng)

最后，作者利用高速旋轉(zhuǎn)的NSTs解析了CaM的C端構(gòu)象變化的動力學(xué)（圖6)。結(jié)果表明，Ca²⁺濃度的變化會引起Ca²⁺和CaM反應(yīng)時間的變化，Ca²⁺濃度越高，反應(yīng)時間越短。通過反應(yīng)方程的計算，表明一個單分子CaM伴隨著協(xié)同計量數(shù)為2.43個Ca²⁺參與反應(yīng)，證實了Ca²⁺N端埋藏在內(nèi)部，而C端暴露在外發(fā)生構(gòu)象變化。

圖6：Ca²⁺協(xié)同誘導(dǎo)的單分子CaM構(gòu)象變化動力學(xué)

作者引入了高速旋轉(zhuǎn)的NSTs作為一種無標(biāo)記探針，用于監(jiān)測單個CaM的構(gòu)象變化動力學(xué)。NST的旋轉(zhuǎn)運動由隨機熱力驅(qū)動，當(dāng)Ca²⁺結(jié)合時，CaM發(fā)生可逆構(gòu)象轉(zhuǎn)換，CaM和基底的疏水相互作用抑制了NST的旋轉(zhuǎn)。動力學(xué)分析揭示了1.81的Hill系數(shù)和2.43的Ca²⁺結(jié)合化學(xué)計量比，為CaM C末端結(jié)構(gòu)域協(xié)同結(jié)合兩個Ca²⁺離子提供了定量證據(jù)。納米陀螺作為一個有效探針平臺，可用于以毫秒級分辨率探測蛋白質(zhì)-配體相互作用及單分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變的研究。該方法在研究離子調(diào)控的信號通路以及與細(xì)胞生理學(xué)和神經(jīng)科學(xué)相關(guān)的動態(tài)蛋白質(zhì)功能方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

該研究相關(guān)論文發(fā)表在Journal of the American Chemical Society上，第一作者為南京大學(xué)博士生劉瑞和博士后唐卓棟，南京大學(xué)陳子軒副教授為獨立通訊作者。研究得到國家自然科學(xué)基金等項目資助。

陳子軒，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院副教授，博士生導(dǎo)師，基金委優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者。2015年博士畢業(yè)于南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，2016年起在南京大學(xué)工作，任副研究員，2021年起任副教授。主要研究方向為：1）光學(xué)顯微儀器的研制；2）單細(xì)胞、單分子、單顆粒傳感；3）納米電分析化學(xué)。在Nat. Commun.、Sci. Adv.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem.等期刊上發(fā)表SCI論文40余篇，主持了國家優(yōu)秀青年基金、面上項目等科研項目。

朱俊杰，南京大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，研究生院副院長，國家杰青，英國皇家化學(xué)會會士。1984年在南京大學(xué)獲學(xué)士學(xué)位，1993年在南京大學(xué)獲博士學(xué)位，1998-1999年在以色列巴伊蘭大學(xué)從事博士后研究。朱俊杰教授主要研究內(nèi)容涉及生物納米電化學(xué)、納米與生物成像、納米材料的生物應(yīng)用等。近年來，在基于納米探針的光學(xué)顯微成像技術(shù)開發(fā)、面向腫瘤的納米診療系統(tǒng)的構(gòu)建以及基于納米材料的新型生物燃料電池研究等方面取得了一系列創(chuàng)新性成果。

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