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然而，FTO具有高度的細(xì)胞環(huán)境復(fù)雜性，其在不同細(xì)胞、組織中的表達(dá)水平以及亞細(xì)胞定位差異較大，并且不同環(huán)境刺激會導(dǎo)致FTO的亞細(xì)胞定位發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，影響著FTO的功能發(fā)揮，導(dǎo)致體外實(shí)驗(yàn)無法完全模擬在細(xì)胞環(huán)境中FTO的真實(shí)狀態(tài)。因此，亟需開發(fā)一種新型探針，在活細(xì)胞和活體層面對FTO進(jìn)行動(dòng)態(tài)、準(zhǔn)確的成像分析。

近日，中山大學(xué)的戴宗/潘逸航/許宇智團(tuán)隊(duì)首次提出了一種計(jì)算機(jī)輔助篩選的、去甲基化可變構(gòu)的適配體探針設(shè)計(jì)（DSA-m⁶A sensor），實(shí)現(xiàn)了m⁶A去甲基化酶FTO的單細(xì)胞、3D腫瘤球和活體層面的無延時(shí)成像分析以及抑制劑篩選。該設(shè)計(jì)由m⁶A修飾的適配體序列（Aptamer）、與適配體部分互補(bǔ)的封閉模塊（Blocker）以及基于poly-T的連接模塊（Linker）三個(gè)模塊組成，兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)形成分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)。該設(shè)計(jì)將“分子識別”、“相互作用”和“信號輸出”三個(gè)部分高度集成到單個(gè)DNA分子開關(guān)中，形成通用型并且可定制的成像平臺。

作為概念驗(yàn)證，以“能量通貨”三磷酸腺苷（ATP）的適配體序列作為構(gòu)建DSA-m⁶A的Aptamer模塊。特異性位點(diǎn)的m⁶A修飾可高效抑制ATP適配體的活性，首先利用計(jì)算機(jī)輔助方式對潛在的m⁶A修飾位點(diǎn)進(jìn)行高效篩選，模擬結(jié)果表明，ATP適配體的A10位點(diǎn)的m⁶A甲基化會導(dǎo)致ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的錯(cuò)誤折疊并削弱分子間作用力，從而導(dǎo)致適配體的結(jié)合活性顯著降低。根據(jù)計(jì)算機(jī)篩選結(jié)果構(gòu)建DSA-m⁶A₁₀傳感器，與無m⁶A修飾的wt-DSA相比，DSA-m⁶A₁₀與ATP配體的結(jié)合能力下降約90%。隨后通過FTO介導(dǎo)的去甲基化作用，恢復(fù)原有的結(jié)合活性，實(shí)現(xiàn)將近10倍的熒光信號恢復(fù)。該傳感器由FTO激活后可以被0.5 mmol/L ATP（細(xì)胞內(nèi)ATP濃度為0.5 ? 5 mmol/L）在1.64秒內(nèi)快速驅(qū)動(dòng)，有望實(shí)現(xiàn)無延時(shí)的FTO酶活性分析。

該傳感器被應(yīng)用于FTO的體外靈敏檢測和FTO抑制劑的高效篩選。其簡單的“一鍋法”步驟有望實(shí)現(xiàn)高通量的抑制劑篩選。此外，該傳感器還成功地應(yīng)用于單一細(xì)胞內(nèi)完整的FTO核質(zhì)異位過程的動(dòng)態(tài)示蹤，提供了單個(gè)細(xì)胞里FTO的時(shí)空分布信息，有助于研究FTO空間調(diào)控的分子基礎(chǔ)。進(jìn)一步利用微流控液滴技術(shù)構(gòu)建了仿生異質(zhì)型的3D細(xì)胞球模型，該模型由高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞與正常乳腺細(xì)胞在GelMA水凝膠中混合形成。成像結(jié)果表明，該傳感器的熒光信號在3D細(xì)胞球模型中與癌細(xì)胞高度定位，能夠清晰區(qū)分癌細(xì)胞與正常細(xì)胞。最后，該傳感器被應(yīng)用于乳腺癌MCF-7皮下荷瘤小鼠的FTO酶活性成像，實(shí)現(xiàn)首例FTO酶活性的活體成像研究。

與以往所報(bào)道的熒光RNA適配體或金屬離子驅(qū)動(dòng)的DNAzyme、CRISPR系統(tǒng)相比，以“能量通貨”ATP驅(qū)動(dòng)的DSA-m⁶A₁₀具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）Lag-free無延時(shí)的傳感過程，其快速的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)能夠在活細(xì)胞、活體中實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確示蹤FTO的動(dòng)態(tài)變化；（2）Self-sufficient 自給自足型傳感器，無須額外添加外源物質(zhì)，不會改變微環(huán)境，能夠呈現(xiàn)FTO的自然狀態(tài)；（3）Highly-integrated高度集成化的模塊設(shè)計(jì)，理論上適用于任何DNA適配體和任一能夠抑制適配體活性的表觀修飾。這種簡單而通用的傳感策略將為RNA去甲基化的基礎(chǔ)研究、臨床診斷、藥物開發(fā)等提供一個(gè)有應(yīng)用前景的工具，同時(shí)也為發(fā)展活體內(nèi)其他表觀遺傳關(guān)鍵酶的動(dòng)態(tài)成像分析提供新穎性的思路和通用的平臺。

這一成果近期發(fā)表在Journal of the American Chemical Society上，并申請中國發(fā)明專利一項(xiàng)。文章的通訊作者為中山大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院戴宗教授以及中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院的潘逸航教授、許宇智助理研究員，第一作者為中山大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士研究生施亞坤。研究成果得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國家自然科學(xué)基金、廣東省傳感技術(shù)與生物醫(yī)療儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、深圳市醫(yī)學(xué)研究專項(xiàng)資金、深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目及廣東省自然科學(xué)基金等項(xiàng)目資金的支持。