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2024年4月17日國際頂級期刊Nature（《自然》）在線發(fā)表了題為“Digital colloid-enhanced Raman spectroscopy by single-molecule counting”的研究論文。該研究針對表面增強拉曼光譜領(lǐng)域內(nèi)定量的挑戰(zhàn)，系統(tǒng)闡述了基于數(shù)字膠體增強拉曼光譜（digital colloid-enhanced Raman spectroscopy, dCERS）的定量技術(shù)。基于單分子計數(shù)，dCERS成功實現(xiàn)了超低濃度目標分子的可靠定量檢測，為表面增強拉曼光譜技術(shù)的普遍應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

本文的第一作者為上海交通大學生物醫(yī)學工程學院致遠榮譽計劃博士研究生畢心緣，通訊作者為葉堅教授。作為資深作者，邵志峰教授在基本概念、數(shù)據(jù)解析以及文章的凝練、修改等方面做出了關(guān)鍵貢獻。Daniel M. Czajkowsky教授也對數(shù)據(jù)的物理原理與文章修改做出了重要貢獻。上海交通大學是論文的唯一完成單位和通訊單位。

研究背景

拉曼散射（Raman scattering）是Chandrasekhara Venkata Raman于1928年發(fā)現(xiàn)的一種指紋式的、具有分子結(jié)構(gòu)特異性的非彈性散射光譜，并獲得了1930年頒發(fā)的諾貝爾物理學獎。通過拉曼譜峰可以直接判斷對應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)，進而識別具體的分子的類型。該技術(shù)具有無需標記的優(yōu)勢，使其在物理、化學、生物、地質(zhì)、醫(yī)學、國防和公共安全等各個領(lǐng)域均具有重要的應(yīng)用價值。

拉曼信號通常比較弱，因此信號增強就變得非常有必要。表面增強拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）源于1974年英國南安普敦大學化學系Martin Fleischmann等人的一個重要實驗。他們發(fā)現(xiàn)，在粗糙的銀電極表面所附著的吡啶分子所產(chǎn)生的拉曼散射信號會被極大地增強，其物理原理在1977年分別由美國西北大學化學系David L. Jeanmaire和Richard P. Van Duyne以及英國肯特大學化學實驗室M. Grant Albrecht和J. Alan Creighton從電磁場效應(yīng)和電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)做出了解釋。1997年SERS迎來了里程碑的事件——單分子SERS檢測的實現(xiàn)。自此，SERS技術(shù)被認為有希望使得拉曼光譜第二次獲得諾貝爾獎。迄今為止，研究人員開發(fā)了各種不同的納米增強基底，如納米星、納米海膽、納米花、納米森林等，通過采用不同的濕化學合成方案與芯片制造工藝，使得基底表面具有更為豐富的尖端、縫隙結(jié)構(gòu)，形成更強的熱點區(qū)域為其中的分子提供更高的增強能力，實現(xiàn)超低濃度的分子檢測。

但是，隨著SERS研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在低濃度檢測時，拉曼信號強度存在極大的不可重復(fù)性。因此，具有單分子檢測的靈敏度并不意味著超靈敏定量的實現(xiàn)。換言之，獲得更高的增強因子只是實現(xiàn)SERS高靈敏定量檢測的必要條件，而只有實現(xiàn)了具有可重復(fù)性的測量，SERS技術(shù)才具有實際應(yīng)用與大規(guī)模推廣的能力。很顯然，這一困擾拉曼領(lǐng)域幾十年的難題，難以在現(xiàn)有的技術(shù)框架中得到圓滿解決。

圖1. 數(shù)字膠體增強拉曼光譜技術(shù)概念圖。

dCERS成功實現(xiàn)具有普適意義的1fM水平定量靈敏度

上海交通大學生物醫(yī)學工程學院葉堅教授和邵志峰教授團隊發(fā)明了數(shù)字膠體增強拉曼光譜（dCERS），利用膠體納米顆粒，可以實現(xiàn)較高效率的單分子檢測。雖然單分子信號強度波動巨大，這與過去的研究結(jié)果相吻合，但與常見的單分子SERS技術(shù)不同的是，通過將光譜根據(jù)是否存在目標分子拉曼特征峰進行0/1數(shù)字化，亦即陰性光譜和陽性光譜（數(shù)字信號），隨后對溶液中的陽性光譜進行計數(shù)。通過該單分子計數(shù)的方式可以實現(xiàn)對多種分子（如染料分子、代謝小分子、核酸、蛋白）的定量檢測，定量檢測限可以達到1 fM以下（圖2）。其中，dCERS技術(shù)所采用的膠體顆粒的合成步驟簡單，易于放大生產(chǎn)，在應(yīng)用中，可以方便地取出每個批次的少量顆粒來針對具體的目標分子預(yù)先建立標準曲線，從而可以可靠地用于后續(xù)未知濃度樣本的定量。

圖2. dCERS定量檢測原理與不同種類分子的定量標準曲線。

定量重復(fù)性精準可控

在實驗中他們發(fā)現(xiàn)，這些通過閾值確定的單分子事件，其出現(xiàn)次數(shù)的分布完全符合泊松統(tǒng)計，因此通過陽性光譜的數(shù)量，可以直接簡單地確定定量靈敏度與準確性，這與傳統(tǒng)的基于模擬信號的定量方法完全不同。如圖3所示，通過增加檢測總光譜數(shù)，可以累積陽性光譜數(shù)量，從而有效提升定量的準確性，定量檢測誤差服從泊松噪聲。因此在真實應(yīng)用場景下，可以根據(jù)分子的檢出概率和對于準確性、檢測總時長等的需求，通過累積陽性光譜數(shù)來調(diào)控定量檢測的準確性，由此dCERS定量檢測具備精準可控的可重復(fù)性。

他們的發(fā)現(xiàn)還證明，針對不同的目標分子，盡管濃度與單分子計數(shù)的依賴關(guān)系具有不同的系數(shù)（需要分別進行標定），這些關(guān)系都符合吉布斯熱力學的理論。事實上，這是第一次明確建立了單分子統(tǒng)計的物理基礎(chǔ)，并可能適用于拉曼光譜之外的其它單分子計數(shù)技術(shù)。

圖3. dCERS定量檢測誤差服從泊松分布。

在環(huán)境保護、食品安全等領(lǐng)域的實用性

為了確立dCERS在實際測量中的潛力，該團隊選取了百草枯和福美雙作為展示實例（圖4）。百草枯是一種高效、劇毒的除草劑，可以誘導(dǎo)帕金森氏病的發(fā)生，目前已有32個國家嚴格禁止其使用。福美雙是一種含硫劇毒殺真菌劑，被歐盟歸為二類致癌物。因此，超高靈敏度的、準確可靠的定量檢測技術(shù)對于這些分子的檢測非常重要，尤其是致癌物，原則上不存在安全劑量。

選取普通的湖水作為背景并混入微量的百草枯，該團隊成功實現(xiàn)了低于歐盟最大殘留量規(guī)定三個數(shù)量級的檢測靈敏度。對于福美雙，該團隊選取了實驗室培養(yǎng)的豆芽提取液，達到了優(yōu)于質(zhì)譜五個數(shù)量級的檢測靈敏度。他們證明了，通過系列稀釋的方法，檢測中的背景干擾可以得到完美的抑制，從而實現(xiàn)準確的靶分子濃度的測量。而dCERS的超高靈敏度和可靠的統(tǒng)計分布是實現(xiàn)這些定量測量的關(guān)鍵基礎(chǔ)。

圖4. dCERS在微量分子檢測中的應(yīng)用。

本工作展示了dCERS技術(shù)基于單分子計數(shù)實現(xiàn)了超低濃度目標分子在未知復(fù)雜背景中的可重復(fù)性定量，無需使用任何目標分子的特定標記。由于不同的目標分子大多具有獨特的SERS光譜，dCERS可以實現(xiàn)多種不同分子的同時定量檢測，因此具有很好的應(yīng)用前景。另外，本工作使用的膠體納米顆粒可以方便地進行大規(guī)模生產(chǎn)和制備，而檢測方法相對簡單，因此，dCERS有望進一步推動高靈敏檢測技術(shù)的變革和進步。

今年剛好是發(fā)現(xiàn)SERS技術(shù)的50周年，可以預(yù)見，隨著dCERS技術(shù)的進一步成熟，dCERS在生命科學、臨床醫(yī)學、環(huán)境保護、食品檢測、國防與公共安全以及基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域都會得到廣泛的應(yīng)用。

圖5. 該成果成員：（從左往右）邵志峰、葉堅、畢心緣、Daniel M. Czajkowsky。

實驗室網(wǎng)站：http://www.yelab.sjtu.edu.cn/

該工作得到了上海交通大學古宏晨教授、徐宏教授和沈峰教授的幫助，得到了國家自然科學基金委、國家重點研發(fā)計劃、上海市科學技術(shù)委員會、上海市婦科腫瘤重點實驗室、上海交通大學、王寬誠教育基金會的資助。

原文鏈接： https://www.nature.com/articles/s41586-024-07218-1