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細胞-細胞相互作用是生命過程中最基本的信息傳遞方式之一，在免疫應(yīng)答、組織發(fā)育和神經(jīng)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，了解細胞間相互作用對于理解免疫過程的生物學(xué)基礎(chǔ)和疾病發(fā)病機制及發(fā)展細胞免疫療法都具有重要意義。

目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)了許多用于研究細胞-細胞相互作用的工具。包括顯微鏡成像技術(shù)、基于鄰近效應(yīng)的化學(xué)標記策略、用于檢測細胞間相互作用的機械力拉伸策略、以功能為導(dǎo)向的對細胞間相互作用進行探索的手段以及單細胞基因表達為基礎(chǔ)的預(yù)測分析方法等。開發(fā)這些技術(shù)的目的是為了解決一些關(guān)鍵的生物學(xué)問題，如：細胞-細胞相互作用發(fā)生在哪些位置？相互作用的空間和組織結(jié)構(gòu)是怎樣的？哪些細胞能夠發(fā)生相互作用？有哪些生物大分子介導(dǎo)細胞間相互作用？如何通過操控這些生物大分子來調(diào)控細胞間的相互作用等。

近年來，通過鄰近標記效應(yīng)為基礎(chǔ)的化學(xué)標記策略捕獲細胞-細胞相互作用是化學(xué)生物學(xué)的研究熱點，該策略已經(jīng)被證明是研究細胞間相互作用的強有力工具，其主要過程是將酶或小分子催化劑裝載到一種細胞上，這種細胞通常被稱之為誘餌細胞，在酶或小分子催化劑催化下激活溶液中連有生物素的底物，將其標記到與誘餌細胞相互作用的細胞上，進而對細胞-細胞相互作用進行捕獲（圖1）。由于該策略可以通過鏈霉親和素對生物素信號進行親和富集，再通過質(zhì)譜、凝膠成像、顯微鏡、流式細胞儀或基因測序進行檢測和下游分析，能夠極大程度實現(xiàn)我們研究細胞間相互作用想要解決關(guān)鍵生物學(xué)問題的目的，所以開發(fā)更有效的研究細胞間相互作用的鄰近標記工具十分必要。

圖1 鄰近標記工具捕獲細胞間相互作用流程及應(yīng)用

近年來，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院李劼團隊和合作者一起利用酶和小分子催化劑設(shè)計構(gòu)建了多種用于研究細胞間相互作用的鄰近標記工具（Cell, 2020, 183, 1117；J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 5517）。為了進一步滿足免疫學(xué)和醫(yī)學(xué)中的不同應(yīng)用場景，他們基于之前用于研究DC-T細胞間相互作用的FucoID技術(shù)，利用巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（FT）的定點化學(xué)偶聯(lián)發(fā)展了細胞-酶偶聯(lián)體探針（Cell-sFT）和抗體-酶偶聯(lián)體探針（Ab-sFT）。當有其它細胞與誘餌細胞相互作用時，FT可以將鳥苷二磷酸巖藻糖生物素（GDP-Fucose-Biotin）的底物標記到與誘餌細胞相互作用的細胞上的N-乙酰-D-乳糖胺（LacNAc）上，進而對細胞間相互作用實現(xiàn)捕獲。另外，他們還利用過渡金屬釕配合物Ru(bpy)₃²⁺開發(fā)了光控的Ru-¹O₂-hydrazide系統(tǒng)用于捕獲細胞-細胞相互作用，通過生物正交反應(yīng)分別將Ru(bpy)₃²⁺與1，2-雙（二苯膦）乙烷（DPPE）、抗體（Herceptin）和鳥苷二磷酸巖藻糖（GDP-Fucose）偶聯(lián)在一起，合成了三種Ru(bpy)₃²⁺衍生物：Ru-L、Ru-G和Ru-H，成功實現(xiàn)將Ru(bpy)₃²⁺裝載到誘餌細胞表面的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和糖分子上，在450 nm光照和底物生物素酰肼（Biotin-hydrazide）存在下通過單線態(tài)機理對細胞間相互作用實現(xiàn)捕獲（圖2）。

圖2 鄰近標記工具箱中所含的探針、裝載和作用機理

Cell-sFT、Ab-sFT、Ru-L、Ru-G和Ru-H這些探針共同組成了研究細胞-細胞相互作用的鄰近標記工具箱，利用這些探針他們將酶或小分子催化劑分別裝載到了鼠的樹突細胞、癌細胞和OT-I T細胞、人的CAR-T細胞和癌細胞上，對由肽主要組織相容復(fù)合物-T細胞受體（pMHC-TCR）所介導(dǎo)的樹突細胞-T細胞、癌細胞-T細胞和T細胞-樹突細胞間的相互作用、由嵌合抗原受體-抗原（CAR-antigen）所介導(dǎo)的T細胞-癌細胞間的相互作用和程序性死亡受體-配體（PD-1-PD-L1）所介導(dǎo)的T細胞-癌細胞間的相互作用實現(xiàn)成功捕獲，展現(xiàn)了鄰近標記工具箱捕獲細胞間相互作用的通用性；另外他們還闡述了工具箱捕獲細胞間相互作用具有可定量性、高選擇性和高分辨（Ru-¹O₂-hydrazide系統(tǒng)）等特點（圖3）。值得指出的是，該系統(tǒng)可以實現(xiàn)對CD4 T細胞和不同抗原呈遞細胞的特異性和異質(zhì)性的解析，解決了免疫學(xué)研究中二類分子MHC多聚體和TCR多聚體難以構(gòu)建的問題。

圖3 鄰近標記工具箱研究細胞-細胞相互作用的特點

在未來的免疫學(xué)研究中，細胞間鄰近標記工具可以廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)未知的細胞間相互作用。例如，李劼團隊利用其開發(fā)的Cell-sFT探針，成功揭示了樹突狀細胞（DC）與B細胞間存在的強相互作用，并在鄰近標記下游結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序分析闡述了DC-B細胞相互作用的機制，為將來研究人員發(fā)現(xiàn)更有意義的未知細胞間相互作用及機制提供了研究范式（圖4）。未來的研究可以探索將鄰近標記工具箱與單細胞測序分析平臺相結(jié)合的可能性。這種結(jié)合可以更加方便和高效地了解介導(dǎo)細胞相互作用的分子信息，為人們深入理解維持正常生理過程和引起疾病發(fā)病過程中的重要細胞相互作用及其機制提供了新思路。

圖4 利用細胞間鄰近標記工具發(fā)現(xiàn)未知的細胞間相互作用。

上述研究成果以“Use of Intercellular Proximity Labeling to Quantify and Decipher Cell-cell Interactions Directed by Diversified Molecular Pairs”和“Ru(bpy)₃²⁺-Enabled Cell-Surface Photocatalytic Proximity Labeling toward More Efficient Capture of Physically Interacting Cells”為題分別發(fā)表在Science Advances和Angewandte Chemie International Editions雜志上，文章鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.add2337 和https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202303014。李劼教授為上述文章的通訊作者，化學(xué)化工學(xué)院博士生邱爽、鄧濤和碩士生李皖楠為上述文章的第一作者。該工作得到國家重點研發(fā)計劃（2019YFA09006600）、國家自然科學(xué)基金（21977048，92053111）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20202004）、北京分子科學(xué)國家實驗室（BNLMS202008）及南京大學(xué)卓越計劃的資助。

研究人員可以根據(jù)不同的目的和需求，有針對性地從鄰近標記工具箱中選擇合適的工具來探究不同的細胞間相互作用。李劼團隊非常樂意分享細胞間鄰近標記工具，并根據(jù)具體生物應(yīng)用場景協(xié)助進一步“定制”開發(fā)工具。