光學(xué)純的手性扁桃酸及其衍生物是有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)中常用的手性拆分劑及醫(yī)藥中間體，應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)有的扁桃酸手性合成策略依賴過渡金屬催化的不對(duì)稱氫化或是有毒試劑氰化物的使用，存在反應(yīng)條件苛刻、試劑昂貴和對(duì)環(huán)境不友好等缺陷。因此，開發(fā)綠色、高效、無氰化物的扁桃酸不對(duì)稱合成技術(shù)具有重要意義。

　　針對(duì)上述問題，中國科學(xué)院上海藥物研究所廖蒼松團(tuán)隊(duì)與鄭明月團(tuán)隊(duì)合作，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種基于C₁延長策略的三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)和工程大腸桿菌，以苯甲醛類化合物和甘氨酸為原料，高效不對(duì)稱合成扁桃酸類化合物。相關(guān)成果以“Asymmetric C₁ Extension of Aldehydes through Biocatalytic Cascades for Stereodivergent Synthesis of Mandelic Acids”為題于2023年3月16日在線發(fā)表于Angew Chem Int Ed。

圖一：三酶級(jí)聯(lián)催化不對(duì)稱扁桃酸合成

　　在本研究中，研究人員通過逆生物合成分析，設(shè)計(jì)了包含_L-苯絲氨酸醛縮酶(LTA)、_L-苯絲氨酸脫氨酶(LTD)和4-羥基扁桃酸合成酶(HmaS)的三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并通過文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫挖掘，對(duì)上述酶進(jìn)行了篩選，組合優(yōu)化在體外構(gòu)建了三酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究人員首次發(fā)現(xiàn)了HmaS催化活性口袋中關(guān)鍵氨基酸殘基的突變體AoHmaS_S201V相較于AoHmaS_wt顯示出對(duì)映選擇性完全反轉(zhuǎn)的結(jié)果，通過分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)，初步闡釋了對(duì)映選擇性翻轉(zhuǎn)的可能酶分子機(jī)制。研究人員利用對(duì)映選擇性反轉(zhuǎn)的突變體，同時(shí)成功實(shí)現(xiàn)了S-和R-型扁桃酸類化合物的高效合成。

　　研究人員基于級(jí)聯(lián)反應(yīng)構(gòu)建了工程菌株E.coli (PpLTA-RpLTD-AoHma_Swt) 和E.coli (PpLTA-RpLTD-AoHmaSS201V)作為全細(xì)胞催化劑，并優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件。全細(xì)胞反應(yīng)優(yōu)化過程中，團(tuán)隊(duì)利用芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶敲除的大腸桿菌中作為底盤細(xì)胞，避免了扁桃酸合成過程中的競爭反應(yīng)，提高了目標(biāo)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率。最終，團(tuán)隊(duì)利用工程菌株催化合成15個(gè)S構(gòu)型的扁桃酸類化合物（圖二）及25個(gè)R構(gòu)型的扁桃酸類化合物（圖三），該方法顯示了高收率及高立體選擇性，最高產(chǎn)率>99%，最高ee值>99%。同時(shí)研究人員也成功實(shí)現(xiàn)了抗血栓藥物氯吡格雷重要藥物中間體(R)-鄰氯扁桃酸的克級(jí)規(guī)模制備，產(chǎn)率為81%，ee值為98%。

圖二：三酶級(jí)聯(lián)催化(S)-扁桃酸合成

圖三：三酶級(jí)聯(lián)催化(R)-扁桃酸合成

　　通過本項(xiàng)研究，合作團(tuán)隊(duì)開發(fā)了高效的生物催化級(jí)聯(lián)反應(yīng)和工程菌，從易得原料苯甲醛及甘氨酸出發(fā)，以高產(chǎn)率和高對(duì)映選擇性獲得各種手性扁桃酸衍生物，該方法無需額外添加輔助因子，為扁桃酸類化合物的不對(duì)稱合成提供了無氰化物的綠色生物合成新技術(shù)。

　　上海藥物所廖蒼松研究員、鄭明月研究員以及廖蒼松團(tuán)隊(duì)毛迎樂助理研究員為論文共同通訊作者，上海藥物所-南京中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)研究生劉燕瓊、上海藥物所博士后付尊蘊(yùn)以及研究助理董海鴻為論文第一作者。該論文得到國家自然科學(xué)基金、上海市自然科學(xué)基金、臨港實(shí)驗(yàn)室等項(xiàng)目的資助。

　　全文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202300906