多取代的6元環(huán)骨架是藥物分子和活性天然產(chǎn)物中常見的結(jié)構(gòu)單元。近年來，對(duì)于手性環(huán)己烷的合成研究受到學(xué)術(shù)界和制藥工業(yè)界的廣泛關(guān)注。狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（Diels-Alder reaction，簡稱D-A反應(yīng)）即共軛雙烯（二烯體）與取代烯烴（親二烯體）之間發(fā)生的[4+2]環(huán)加成反應(yīng)，是合成化學(xué)中構(gòu)建六元環(huán)骨架最常用的方法之一，已經(jīng)在天然產(chǎn)物全合成中得到了廣泛運(yùn)用。但傳統(tǒng)的不對(duì)稱D-A反應(yīng)在立體選擇性以及反應(yīng)模塊性方面存在明顯的不足，這極大的限制了其在藥物合成上的應(yīng)用。鑒于酶催化往往具有高效、綠色的特點(diǎn)，近年來對(duì)于D-A反應(yīng)酶的挖掘和工程化改造受到廣泛關(guān)注。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院雷曉光課題組在此前的工作中，從桑樹中發(fā)現(xiàn)了首例催化分子間endo 或exo選擇性D-A反應(yīng)的酶（MaDAs），并對(duì)其催化機(jī)理，底物范圍進(jìn)行了深入研究，為進(jìn)一步對(duì)該家族的酶工程改造奠定了基礎(chǔ)（Gao et al, Nat. Chem., 2020, 12, 620；Gao et al, Nat. Catal., 2021, 4, 1059）。2022年11月16日，雷曉光課題組在在Cell Press細(xì)胞出版社期刊Chem Catalysis 上報(bào)道了針對(duì)D-A酶MaDA1的蛋白工程改造，并通過將酶催化的D-A反應(yīng)與金屬催化脫羧官能團(tuán)化反應(yīng)巧妙結(jié)合，利用生物催化與化學(xué)催化相輔相成和優(yōu)勢互補(bǔ)的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了環(huán)己烯骨架的多樣性導(dǎo)向、精準(zhǔn)合成。該研究工作為結(jié)構(gòu)多樣的六元環(huán)骨架的合成提供了新的思路，拓展了酶催化的應(yīng)用范圍。本研究巧妙地設(shè)計(jì)了親雙烯體1a，在與天然底物具有一定相似性的同時(shí)引入供后期脫羧官能團(tuán)化的羧基前體酯基，以實(shí)現(xiàn)酶催化的D-A反應(yīng)之后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)一步的多樣性衍生。經(jīng)過酶催化活性篩選，作者發(fā)現(xiàn)D-A酶MaDA1能夠?qū)崿F(xiàn)所設(shè)計(jì)的D-A反應(yīng)，但反應(yīng)收率、選擇性需要進(jìn)一步優(yōu)化（43%， 93 ee%， 192 TTN， endo/exo = 4/1），對(duì)于MADA1的工程化改造勢在必行。作者采用聚焦理性迭代位點(diǎn)特異性突變的策略（focused rational iterative site-specific，mutagenesis, FRISM），以極小的突變成本便獲得了最佳突變體。首先利用丙氨酸篩選，對(duì)MaDA1口袋29個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變，確定了五個(gè)突變熱點(diǎn)?？紤]到丙氨酸（A）、纈氨酸（V）、絲氨酸（S）、苯丙氨酸（F）等四種氨基酸在具有不同大小的同時(shí)，能夠誘導(dǎo)底物與酶形成不同的相互作用，故以這四種氨基酸對(duì)選定熱點(diǎn)進(jìn)行突變。經(jīng)過了三輪的突變和反應(yīng)條件的優(yōu)化，最佳突變體MaDA1-M3的催化效率提高了34倍，ee 值提高到>99%，產(chǎn)率提高到93%，TTN提高了14倍（如圖1）。
圖1. D-A酶的半理性結(jié)構(gòu)改造過程為了進(jìn)一步拓展最佳突變體MaDA1-M3的應(yīng)用范圍，作者系統(tǒng)探索了MaDa1-M3的底物范圍，其對(duì)多種親雙烯體和雙烯體的D-A反應(yīng)展現(xiàn)出優(yōu)異的活性和立體選擇性，實(shí)現(xiàn)了一系列環(huán)己烯骨架的高效精準(zhǔn)合成，如圖2所示。
進(jìn)一步通過將D-A產(chǎn)物進(jìn)行全局性的酚羥基保護(hù)、芐基脫除、羧基活化，得到了脫羧官能團(tuán)化的前體。該前體可用于多種不同的金屬催化脫羧官能團(tuán)化反應(yīng)（如脫羧烯基化、脫羧炔基化、脫羧芳基化、脫羧烷基化、脫羧氫化、脫羧Giese反應(yīng)、Curtius重排等），從而進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)多樣的環(huán)己烯骨架（如圖3）。通過將生物催化的高立體選擇性與過渡金屬催化的適應(yīng)底物多樣性有機(jī)結(jié)合，快速、高效構(gòu)建結(jié)構(gòu)多樣的化合物庫，為環(huán)己烯類型化合物的藥物篩選和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
圖3. 酶催化D-A反應(yīng)串聯(lián)金屬催化脫羧官能化反應(yīng)綜上所述，雷曉光課題組首次利用丙氨酸篩選與聚焦理性迭代位點(diǎn)特異性突變（FRISM）相結(jié)合的方式，實(shí)現(xiàn)了對(duì)D-A酶的蛋白工程改造，提升了酶催化活性和底物適用性。通過將酶催化的分子間D-A反應(yīng)與多種過渡金屬催化的脫羧官能團(tuán)化反應(yīng)相結(jié)合，成功實(shí)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)多樣的手性環(huán)己烷骨架的構(gòu)建。該工作為多取代手性環(huán)己烷骨架的高效合成提供了新的方法。在該研究中，雷曉光課題組北京大學(xué)“博雅博士后”王進(jìn)博士為第一作者，雷曉光教授以及雷曉光課題組特聘副研究員高磊博士為共同通訊作者。雷曉光課題組的博士研究生楊軍、郭念昕和丁琪在蛋白表達(dá)方面提供了幫助；博士研究生柯瀚、湯汝堯和本科生胡康德龍在底物合成和消旋體產(chǎn)物合成上提供了幫助。該工作得到國家自然科學(xué)基金，國家科技部重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃，北京市“卓越青年科學(xué)家計(jì)劃”，北京分子科學(xué)國家研究中心，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心等多個(gè)國家重大科研項(xiàng)目和研究機(jī)構(gòu)的資助。雷曉光課題組所開展的化學(xué)酶法合成研究工作也得到了瑞士諾華制藥公司的資助。原文（掃描或長按二維碼，識(shí)別后直達(dá)原文頁面）：Diversity-oriented synthesis of cyclohexenes by combining enzymatic intermolecular Diels-Alder reactions and decarboxylative functionalizationsJin Wang, Han Ke, Jun Yang, Nianxin Guo, Kangdelong Hu, Ruyao Tang, Qi Ding, Lei Gao, Xiaoguang LeiChem Catal., 2022, DOI: 10.1016/j.checat.2022.10.027
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