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Angew：構(gòu)建靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的DNA納米裝置，用于膜結(jié)合細(xì)胞器中蛋白質(zhì)的自噬依賴性降解
來(lái)源：化學(xué)加網(wǎng)原創(chuàng) 2022-09-01
導(dǎo)讀：近日，華東理工大學(xué)錢(qián)旭紅院士、楊泱泱教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種通過(guò)自噬依賴性途徑，經(jīng)歷新的細(xì)胞內(nèi)降解的新型DNA納米裝置，該裝置用于特異性捕捉內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）定位的蛋白質(zhì)，并將其運(yùn)輸至溶酶體進(jìn)行降解。這種DNA納米裝置既能高效降解外源性的ER駐留蛋白（ER-eGFP），又能降解癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的分子伴侶（葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78）。文章鏈接DOI: 10.1002/anie.202205509
蛋白質(zhì)是細(xì)胞中最豐富的生物分子，其生物/病理功能與亞細(xì)胞定位密切相關(guān)。例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）是一種必不可少的膜結(jié)合細(xì)胞器（MBO），具有獨(dú)特的化學(xué)環(huán)境，可以在伴侶分子和折疊酶的幫助下進(jìn)行蛋白質(zhì)的折疊和修飾。蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊和異常蛋白質(zhì)表達(dá)可能會(huì)引起ER應(yīng)激，進(jìn)而引起癌癥和神經(jīng)退行性疾病。通過(guò)采用包括泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）和自噬系統(tǒng)的細(xì)胞蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)，靶向蛋白降解（TPD）策略已成為具有代表性的蛋白質(zhì)消除工具。納米材料的最新研究進(jìn)展提供了大量可以靶向亞細(xì)胞區(qū)室的候選材料。其中，DNA納米結(jié)構(gòu)因其可編程的自組裝性，廣泛的功能性及高生物相容性，而被認(rèn)為能夠作為參與疾病治療的治療載體。此外，DNA納米結(jié)構(gòu)已被證實(shí)可作為靶向細(xì)胞器，生物傳感和細(xì)胞凋亡等工具。Krishnan課題組開(kāi)發(fā)了一系列用于檢測(cè)細(xì)胞器內(nèi)離子變化的DNA納米裝置。仰大勇團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種DNA納米結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了線粒體干擾。然而，其他MBO靶向DNA納米裝置還未有報(bào)道。本文描述了一種ER靶向DNA納米結(jié)構(gòu)用于消除大多數(shù)癌細(xì)胞中ER上過(guò)表達(dá)的定位蛋白。該文使用肽-寡核苷酸偶聯(lián)作為人工膜受體（AMR）, AMR可以將自身插入到細(xì)胞膜上。隨后，含有AMR互補(bǔ)序列鏈的凹形DNA裝置（cDOS）通過(guò)與AMR雜交錨定在細(xì)胞表面，開(kāi)啟cDOS的跨膜攝取。本文證明了AMR引導(dǎo)能夠快速有效的運(yùn)送cDOS，并且cDOS在體內(nèi)逃逸后靶向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，隨后經(jīng)過(guò)自噬依賴性的途徑到溶酶體進(jìn)行降解。基于以上的發(fā)現(xiàn)，該課題組提出使用亞細(xì)胞靶向cDOS去構(gòu)建程序化的MBO定位蛋白降解系統(tǒng)，用于調(diào)節(jié)包括外源性ER-駐留蛋白（ER-eGFP）和內(nèi)源性過(guò)表達(dá)分子伴侶（葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78）在內(nèi)的蛋白質(zhì)的豐度（圖1）。
圖1. 靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的DNA納米裝置，用于降解膜結(jié)合細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)(圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.)凹形DNA折紙結(jié)構(gòu)（cDOS）由179個(gè)短鏈DNA及M13mp18支鏈在四步過(guò)程中混合，退火合成。隨后離心三次去除多余的短鏈，最后使用瓊脂糖凝膠電泳和透射電子顯微鏡來(lái)分析cDOS（圖2a,b,c）。pH低插入肽（pHLIPs）是在酸性條件下，能夠形成跨膜 a-螺旋并將自身插入細(xì)胞膜的一系列相應(yīng)肽。本文制備了pHLIPs-寡核苷酸偶聯(lián)物（pHLIP-ON）作為AMR，并用于cDOS內(nèi)化。5’-炔烴連接的寡核苷酸與疊氮連接的pHLIP通過(guò)銅(Ⅰ)催化疊氮化物-炔烴環(huán)加成過(guò)程合成pHLIP-ON（圖2d）。
圖2. (a)(b)(c)凹形DNA 折紙結(jié)構(gòu)表征圖，(d) pHLIP-ON 合成過(guò)程，(e) FAM-pHLIP-ON 分別在pH=7.4, pH=6.5下細(xì)胞膜插入性能(圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.)為了評(píng)估pHLIP-ON的膜插入能力，將其與FAM修飾的單鏈DNA（FAM-ssDNA）雜交，形成雙鏈FAM-pHLIP-ON。作者首先優(yōu)化了培養(yǎng)環(huán)境的pH（弱酸性或正常條件下）（圖2e），評(píng)估了膜錨定pHLIP-ON用作cDOS內(nèi)化的AMR向?qū)У臐摿?。?shí)驗(yàn)結(jié)果表明pHLIP-ON 可以在弱酸性微環(huán)境下被作為特定的AMR, 并在雜交時(shí)承載cDOS (圖3a,b,c)。隨后，使用定量實(shí)時(shí)PCR (qPCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了體系中存在或不存在AMR時(shí)，細(xì)胞對(duì)cDOS的攝取效率。結(jié)果顯示，與單獨(dú)的cDOS相比，在AMR協(xié)助下，細(xì)胞內(nèi)定位過(guò)程中cDOS的攝取效率增加了大約18倍（圖3d）。由于低pH是腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境的共同特征之一，因此該策略可能更適用于靶向癌細(xì)胞而不是健康細(xì)胞。為了證實(shí)這一推測(cè)，作者選用兩種癌細(xì)胞（MCF-7和HepG2）一種健康細(xì)胞（DC2.4）來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。如圖3e，在弱酸性的培養(yǎng)微環(huán)境下，cDOS在MCF-7和HepG2細(xì)胞中均能觀察到有效內(nèi)化，而在健康細(xì)胞DC2.4細(xì)胞內(nèi)未觀察到內(nèi)化。
圖3. (a) FAM-cDOS在弱酸性條件下與預(yù)錨定AMR雜交，內(nèi)化示意圖, (b) 弱酸性條件下 (pH=6.5), (c) 正常條件下 (pH=7.4) cDOS的跨膜性能，(d) cDOS 在存在或不存在AMR下，細(xì)胞對(duì)cDOS攝取效率。(e) cDOS在癌細(xì)胞與健康細(xì)胞中內(nèi)化情況(圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.)隨后，實(shí)驗(yàn)確定了cDOS的內(nèi)吞途徑主要是小窩蛋白依賴性介導(dǎo)途徑。并通過(guò)共定位檢測(cè)后，確定了cDOS跨膜后的走向。如圖4a,c顯示，cDOS被內(nèi)吞4到6h后，其主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。在被內(nèi)吞6h后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上的cDOS逐漸轉(zhuǎn)移至溶酶體（圖4b）。并在孵育12h后，cDOS有效的轉(zhuǎn)移至溶酶體進(jìn)行降解（圖4d）。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了cDOS在內(nèi)吞后，能夠有效的靶向ER，這是DNA納米結(jié)構(gòu)首次在沒(méi)有任何亞細(xì)胞靶向配體的幫助下顯示出亞細(xì)胞靶向能力。
圖4. cDOS在不同時(shí)間 (4、6和12小時(shí)) 在不同細(xì)胞器（ER和溶酶體）中的細(xì)胞間運(yùn)輸情況(圖片來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.)最后，作者選用了包括外源性ER駐留eGFP和內(nèi)源蛋白（葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78）兩種ER定位蛋白，分析該系統(tǒng)的可行性及降解效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cDOS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)可用于自噬-溶酶體途徑進(jìn)行細(xì)胞器定位的蛋白質(zhì)降解。此外，將該系統(tǒng)與特定的腫瘤微環(huán)境響應(yīng)配體相關(guān)聯(lián)可以引導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞器定位蛋白質(zhì)降解，增強(qiáng)腫瘤選擇性。
錢(qián)旭紅院士團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種DNA納米裝置，旨在降解MBO定位的蛋白質(zhì)。這種方法通過(guò)DNA納米裝置與蛋白質(zhì)靶向配體作為彈頭的程序組裝構(gòu)建，隨后將該組件用于靶向到ER定位的蛋白質(zhì)上并攜帶它們進(jìn)行溶酶體降解。該方法表現(xiàn)出外源和內(nèi)源ER定位蛋白的高降解效率。同時(shí)為調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白質(zhì)的豐度提供了新的見(jiàn)解，并可能加速癌癥治療的發(fā)展。
文獻(xiàn)詳情：
Caixia Liu, Bin Wang, Weiping Zhu, Yufang Xu, Yangyang Yang*, Xuhong Qian*, An ER‐targeting DNA Nanodevice for Autophagy‐dependent Degradation of Proteins in Membrane‐bound Organelles. Angew. Chem. Int. Ed. 2022, https://doi.org/10.1002/anie.202205509
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