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肝纖維化是由病毒性乙型或丙型肝炎感染、自身免疫和膽道疾病、酒精性和非酒精性脂肪性肝炎等引起的慢性炎癥，是肝臟疾病發(fā)病率和死亡率的主要原因。纖維化的特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分在肝臟中的逐漸積累，并且很有可能發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌、肝功能衰竭或死亡，使其成為巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。此外，晚期肝纖維化通常被認(rèn)為是不可逆的，終末期肝硬化的唯一治愈方法是移植，這凸顯了早期發(fā)現(xiàn)的必要性?；顧z是了解肝纖維化發(fā)作及其疾病活動(dòng)性，和對(duì)肝纖維化嚴(yán)重程度進(jìn)行病理分期的臨床黃金準(zhǔn)則；然而，活檢是侵入性的，存在取樣誤差和并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)。缺乏檢測(cè)和量化肝纖維化的非侵入性方法極大地阻礙了肝纖維化的診斷以及新療法的開(kāi)發(fā)。

在肝纖維化過(guò)程中，慢性肝損傷導(dǎo)致重塑ECM的肝星狀細(xì)胞活化和增殖。賴氨酰氧化酶(LOX)酶家族的上調(diào)催化ECM（主要是膠原蛋白）上的賴氨酸ε-氨基氧化形成醛賴氨酸(Lys^Ald)，然后與其他蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)以穩(wěn)定纖維化ECM。作者在前期工作中已經(jīng)證明Lys^Ald是纖維化發(fā)生的生物標(biāo)志物，并且用肼官能團(tuán)修飾的基于釓(Gd)的磁共振探針可以在體內(nèi)與Lys^Ald共價(jià)結(jié)合，以量化纖維化的發(fā)展。但是，人們對(duì)基于Gd的造影劑的長(zhǎng)期安全性感到擔(dān)憂。釓與腎源性系統(tǒng)性纖維化有關(guān)，這是一種潛在的致命疾病，伴有硬皮病樣皮膚損傷，發(fā)生在腎功能降低的患者身上。

錳絡(luò)合物是作為MRI造影劑的Gd³⁺絡(luò)合物的有前途的替代品。而且，錳也是人體必需的元素，少量殘留的錳可通過(guò)內(nèi)源性機(jī)制加工清除。此外，Mn具有正電子發(fā)射斷層掃描(PET)同位素⁵²Mn，半衰期為5.6天，因此可以使用PET-MRI在幾天內(nèi)評(píng)估全身藥代動(dòng)力學(xué)。然而，由于缺乏配體場(chǎng)穩(wěn)定能，Mn(II)配合物通常很不穩(wěn)定，迄今為止，僅有有限的具有高熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的Mn(II)配合物的報(bào)道。這是肝臟成像病理學(xué)的一個(gè)特殊挑戰(zhàn)，因?yàn)橛坞xMn²⁺會(huì)被正常肝臟中的肝細(xì)胞大量吸收，從而導(dǎo)致高背景信號(hào)。因此，響應(yīng)性和靶向性錳造影劑的設(shè)計(jì)更具挑戰(zhàn)性。

作者認(rèn)為用于肝纖維化成像的錳基MR探針必須滿足幾個(gè)要求：(1)不與Lys^Ald結(jié)合時(shí)的弛豫低，以盡量減少背景信號(hào)；(2)與Lys^Ald結(jié)合時(shí)具有高弛豫以增加纖維發(fā)生部位的信號(hào)；(3)高動(dòng)力學(xué)惰性，防止游離Mn²⁺釋放造成高肝臟背景信號(hào)；(4)完整配合物的最小肝膽消除，以最小化肝臟背景；(5)一種氧化還原穩(wěn)定的Mn²⁺配合物，因?yàn)镸n³⁺可以氧化肼?；谶@些設(shè)計(jì)要求，作者合理設(shè)計(jì)并合成了新型修飾肼官能團(tuán)的錳基MRI探針，用于檢測(cè)肝纖維化（圖1）。

圖 1. 用于靶向肝纖維化過(guò)程中Lys^Ald的可逆雙結(jié)合錳基MRI探針設(shè)計(jì)示意圖（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）

首先，由于cis-Mn-1,4-DO2A已經(jīng)被證明具有抗氧化穩(wěn)定性以及高熱力學(xué)穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)惰性，因此，作者設(shè)計(jì)了基于cis-Mn-1,4-DO2A結(jié)構(gòu)的雙結(jié)合錳基探針（圖 2）。這種雙結(jié)合位點(diǎn)的設(shè)計(jì)方法能夠有效提高Lys^Ald的反應(yīng)速率，并在結(jié)合時(shí)提供較大的弛豫開(kāi)啟，因?yàn)椤半p鎖定”探針將減少蛋白質(zhì)結(jié)合的Mn復(fù)合物的內(nèi)部運(yùn)動(dòng)。因此，作者將兩個(gè)哌嗪-肼或酰肼部分引入cis-Mn-1,4-DO2A的骨架中以形成Mn(II)配合物Mn-2CHyd和Mn-2Hyd。此外，作者還合成了含有一個(gè)哌嗪-肼的對(duì)照探針Mn-1Chyd。與酰肼相比，哌嗪-肼單元對(duì)Lys^Ald具有更高的反應(yīng)性和親和力。接著，作者對(duì)探針的性能進(jìn)行了表征。在循環(huán)伏安法實(shí)驗(yàn)中，Mn-2CHyd在969 mV (E_pa) 處顯示出不可逆的Mn^II/Mn^III峰和在731 mV處的配體氧化峰，表明Mn²⁺在Mn-2CHyd中不易被氧化。然后，通過(guò)測(cè)量Zn²⁺存在下Mn²⁺配合物的縱向弛豫變化驗(yàn)證了探針對(duì)Mn²⁺釋放的惰性。

圖 2. 錳基MRI探針的結(jié)構(gòu)及其性能表征（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）

然后，作者通過(guò)高效液相色譜結(jié)合電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP MS)比較了配合物與丁醛（一種Lys^Ald的小分子模型）的反應(yīng)性（圖3）。結(jié)果顯示，相應(yīng)腙絡(luò)合物的最快形成的是與Mn-2CHyd形成的絡(luò)合物，在pH 7.4下，轉(zhuǎn)化率和締合速率常數(shù)都比Mn-1CHyd高2倍。與形成雙腙產(chǎn)物的富電子烷基肼Mn-2CHyd相比，帶有Mn-2Hyd的缺電子酰基肼90 min后轉(zhuǎn)化率略低，并且沒(méi)有形成相同反應(yīng)條件下的雙腙產(chǎn)物。Mn-2Hyd的反應(yīng)性在更酸性的條件下(pH 6.5)顯著增加，這表明Mn-2Hyd具有作為pH敏感的Lys^Ald靶向探針的潛力。在所有反應(yīng)過(guò)程中，均未檢測(cè)到游離錳，進(jìn)一步證明了配合物的穩(wěn)定性。

圖 3. 探針的響應(yīng)性能測(cè)試（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）

接下來(lái)，作者驗(yàn)證了Mn(II)配合物與含有牛血清白蛋白(BSA^Ald)的Lys^Ald的反應(yīng)，以評(píng)估蛋白質(zhì)結(jié)合的效果。結(jié)果顯示，在BSA中，所有Mn(II)配合物的弛豫度與PBS中的類似，表明存在可忽略不計(jì)的非特異性結(jié)合。然而，在BSA^Ald中的弛豫度顯著增加，Mn-2Hyd、Mn-1CHyd和Mn-2CHyd分別增加了42%、37%和103%。作者通過(guò)分離BSA^Ald結(jié)合的物質(zhì)進(jìn)一步量化了結(jié)合產(chǎn)率和弛豫度。其中，Mn-2CHyd在不同濃度下顯示出最高的結(jié)合產(chǎn)率。相比之下，蛋白質(zhì)結(jié)合的Mn-1Chyd顯示出較低的弛豫度，從而證明了雙結(jié)合位點(diǎn)的設(shè)計(jì)方法在通過(guò)限制分子旋轉(zhuǎn)來(lái)提高弛豫方面的有效性。

由于Mn-1CHyd和Mn-2CHyd在BSA^Ald中顯示出比Mn-2Hyd更高的反應(yīng)性和弛豫性，作者進(jìn)一步在體內(nèi)測(cè)試了這兩種復(fù)合物，并使用PET-MRI研究了它們?cè)谡Ｐ∈笾械乃幋鷦?dòng)力學(xué)（圖4）。兩種探針在靜脈注射后從血液中快速消除，通過(guò)腎臟進(jìn)入膀胱。然而，Mn-1CHyd在MRI和PET中均顯示出高度的肝臟信號(hào)增強(qiáng)，而隨著時(shí)間的推移，Mn-2CHyd的信號(hào)在健康肝臟中幾乎沒(méi)有增強(qiáng)。24 h后，與來(lái)自Mn-1CHyd的Mn-52相比，來(lái)自Mn-2CHyd的Mn-52在各個(gè)器官中的保留較低。這些研究表明，Mn-1CHyd不適合肝臟的MR成像，因?yàn)樗母闻K攝取會(huì)產(chǎn)生高的非特異性信號(hào)。

圖 4. 體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）

接下來(lái)，作者測(cè)試了Mn-2CHyd是否可以檢測(cè)體內(nèi)肝纖維化（圖5）。首先，作者用CCl₄對(duì)小鼠灌胃12周構(gòu)建了肝纖維化模型。然后，在靜脈注射Mn-2CHyd或Gd-DOTA（陰性對(duì)照）后立即在小鼠中進(jìn)行磁共振成像。相較于對(duì)照造影劑，在注射后45分鐘，Mn-2CHyd顯示出比在健康小鼠中顯著增強(qiáng)的肝臟MR信號(hào)以及更慢的肝臟清除率。這些數(shù)據(jù)表明，Mn-2CHyd對(duì)肝纖維化的體內(nèi)檢測(cè)具有高度靈敏性和特異性。

圖 5. 肝纖維化的體內(nèi)檢測(cè)（圖片來(lái)源：J. Am. Chem. Soc.）