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在自然界中，許多蛋白質(zhì)組裝成特定的寡聚結構，其中包含多個不同蛋白質(zhì)的精確數(shù)量和寡聚序列。這種組裝可以決定蛋白質(zhì)的生物學特性（例如，人IgM抗體包含五個蛋白質(zhì)亞基）、催化特性（例如，真核RNA聚合酶II包含十二個蛋白質(zhì)亞單位）、光物理特性（例如，藍藻光系統(tǒng)I包含十二個蛋白亞基）、和膜轉運特性（例如，青鏈霉菌鉀通道包含四個蛋白質(zhì)亞單元）。為了模仿并可能超越這些特性，需要對不同的蛋白質(zhì)寡聚體進行模塊化合成。盡管使用分子生物學技術（包括基因工程和突變蛋白質(zhì)的重組表達）可以實現(xiàn)制備（Fig. 1A）。然而，通過重組表達制備許多蛋白質(zhì)具有挑戰(zhàn)性（例如，具有翻譯后修飾的蛋白質(zhì)、具有二硫鍵的蛋白質(zhì)、毒蛋白質(zhì)、或聚集的蛋白質(zhì)），這可能限制了通過這些方法可以寡聚的蛋白質(zhì)的范圍。此外，化學方法是另一種控制寡聚的強大方法，如在基于特定位點進行非天然氨基酸的融合表達和附著在化學支架上進行組裝（Fig. 1B）。然而，前者如果沒有廣泛的化學設計、蛋白質(zhì)氨基酸序列的修飾和/或重組蛋白表達，獲得大于二聚體或三聚體的單分散和序列編碼低聚物是一項挑戰(zhàn)。而后者必須改變DNA設計，以合成含有不同數(shù)量或寡聚序列的蛋白質(zhì)寡聚體，這些限制大大阻礙了蛋白質(zhì)寡聚體的構建和后續(xù)研究。

為了解決上述限制，作者提出了一組特定的DNA鏈可以用作模塊化支架，將蛋白質(zhì)組織成具有精確化學計量和寡聚序列的寡聚體（Fig. 1C）。這種DNA設計將使不同的蛋白質(zhì)精確地組織成一系列單分散、序列編碼的低聚物（Fig. 1Ci）。

Fig. 1: 蛋白質(zhì)低聚技術及其局限性 （圖片來源：Chem）

為了驗證上述想法，作者選擇三種通常用作檢查點抑制劑的市售IgG抗體（即抗小鼠PD-1[A]、抗小鼠TIGIT[B]和抗小鼠CTLA-4[C]），使用模塊化DNA支架進行蛋白質(zhì)的序列編碼寡聚。為了將單個DNA鏈安裝到A、B或C上，將每個抗體與2當量含有N-羥基琥珀酰亞胺活化酯和疊氮化物（NHS–PEG12–N3）的低聚（乙二醇）分子反應45分鐘（Fig. 2A）。在通過尺寸排阻色譜（SEC）純化后，每個抗體表面上的疊氮化物與5當量含有二苯并環(huán)辛炔（DBCO）和熒光團的DNA鏈和兩個不同的20堿基核酸序列進行疊氮化合物-炔環(huán)加成（SPAAC）反應。16小時后，約25%-30%的抗體被一條DNA鏈修飾。接下來，使用SEC從反應混合物中去除未反應的DNA。使用陰離子交換色譜法從未反應的抗體和用多條DNA鏈官能化的抗體中分離出用單條DNA鏈功能化的抗體（Fig. 2A）。之后，制備了三種不同的蛋白質(zhì)DNA綴合物（即S2–A–Cy3–S3、S4–B–Cy5–S5和S6–C–FITC–S1），并通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE，F(xiàn)ig. 2B）和SEC確認其含有單一DNA功能化。

Fig. 2: 單鏈DNA的抗體功能化 （圖片來源：Chem）

通過將純化的蛋白質(zhì)DNA綴合物（Fig. 3A和3E：lane 1-3）與模板DNA鏈混合來合成蛋白質(zhì)低聚物。等量的B-DNA綴合物、C-DNA綴合物、S50-60模板鏈、S50-S60模板鏈，混合S10-S20模板鏈以合成具有寡聚序列S4-B-C-S20的蛋白質(zhì)二聚體（Fig. 3B），組裝產(chǎn)率為68%。由于不存在與S4或S20 DNA序列互補的DNA序列，因此在組裝混合物中未觀察到含有多于兩個抗體的低聚物。使用SEC純化從組裝混合物中的未反應單體和模板鏈中分離蛋白質(zhì)二聚體，并用瓊脂糖凝膠電泳進行表征（Fig. 3E: lane 4）。瓊脂糖凝膠顯示二聚體的單一條帶，僅具有預期的Cy5和FITC熒光，電泳遷移率低于單獨的抗體-DNA偶聯(lián)物。結果表明，成功合成了具有寡聚序列S4-B-C-S20的單分散和序列編碼的蛋白質(zhì)二聚體。

Fig. 3: 利用DNA-DNA相互作用將抗體寡聚成編碼序列 （圖片來源：Chem）

接下來，作者將等量的A-DNA綴合物、B-DNA綴合物、C-DNA綴合物、S30-S40模板鏈和S50-S60模板鏈混合，以27%的組裝產(chǎn)率合成具有寡聚序列S2-A-B-C-S1的蛋白質(zhì)三聚體并通過瓊脂糖凝膠電泳對其進行表征（Fig. 3C，3E: lane 5）。此外，作者使用抗原結合和檢查點抑制劑活性細胞測定法研究了用DNA功能化和用模塊化DNA支架寡聚后人抗體的靶向結合特性。結果表明，每個樣品中保留了抗原結合和檢查點抑制劑活性。

最后，作者使用蛋白質(zhì)二聚體和三聚體作為構建模塊成功合成了具有寡聚序列S4–B–C–A–B–C–S1的單分散和序列編碼的蛋白質(zhì)五聚體，其中三種不同的抗體被組織成精確的低聚物序列（Fig. 3D，3E: lane 6）。這是第一個報道的單分散抗體五聚體，其包含預定義寡聚序列中的不同抗體。

總結：

Chad A. Mirkin院士團隊展示了如何使用可推廣的生物偶聯(lián)化學和精心設計的DNA支架合成單分散、序列編碼的蛋白質(zhì)低聚物。因為這種通用的蛋白質(zhì)低聚方法可以合成具有不同化學計量和低聚物序列的低聚物，而無需重新設計蛋白質(zhì)或DNA支架，表現(xiàn)出了其強大性和實用。更為重要的是，這一合成進展將使后續(xù)研究和理解蛋白質(zhì)低聚物結構和性質(zhì)之間的基本關系成為可能，這對許多領域（如治療學、催化、光合作用和膜運輸）具有重大意義。