Fmoc-His(Trt)-OH 是最容易外消旋的多肽合成中的氨基酸。如此高的不穩(wěn)定性是主要歸因于其側(cè)鏈不受保護的咪唑基Nπ可以在分子內(nèi) 進攻Hα ，而后者的酸度會隨著 Fmoc-His(Trt)-OH的活化而增強。所得碳負(fù)離子的再質(zhì)子化導(dǎo)致 His-Cα 消旋化（Scheme 1）。Scheme 1. Fmoc-His(Trt)-OH 活化和由 His-Nτ 引導(dǎo)的偶聯(lián)過程中組氨酸的消旋化。總的來說，在 多肽固相合成(SPPS) 中可實施兩種氨基酸活化策略，即原位 in situ活化和預(yù)活化。在原位活化策略中，將 Fmoc-Xaa-OH 和偶聯(lián)劑依次添加到底物肽樹脂中，而無需預(yù)先混合。Fmoc-Xaa-OH在偶聯(lián)試劑存在下 與肽-Nα 的偶聯(lián)以一鍋法發(fā)生。因此，在原位活化策略中，活化的 Fmoc-Xaa-OH 的存在期被最小化。反之，當(dāng)采用預(yù)活化策略時，F(xiàn)moc-Xaa-OH 和偶聯(lián)劑在偶聯(lián)反應(yīng)之前混合。預(yù)活化過程通常需要幾分鐘才能將 Fmoc-Xaa-OH 轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)的活化物質(zhì)。當(dāng)預(yù)活化到期時，將活化的 Fmoc-Xaa-OH 添加到肽樹脂中以啟動目標(biāo)偶聯(lián)反應(yīng)。盡管原位活化策略可以有效縮短活化的 Fmoc-Xaa-OH 物種的存在期，這可能有助于緩解氨基酸外消旋化，但預(yù)活化策略仍被工業(yè)界廣泛采用。這是考慮到偶聯(lián)試劑和肽-Nα 部分之間的副反應(yīng)導(dǎo)致的肽鏈終止，uronium和碳二亞胺偶聯(lián)劑可以將伯氨基和仲氨基轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的胍物質(zhì)（Scheme 2）。Scheme 2. DIC 介導(dǎo)的 Fmoc-Xaa-OH 活化/偶聯(lián)和封端終止肽鏈副反應(yīng)在該研究項目中，一個Fmoc-His(Trt)-OH 縮合反應(yīng)所導(dǎo)致的消旋化副反應(yīng)被以DOE的方式進行研究優(yōu)化。DIC/HOBt被用作縮合試劑和縮合添加劑。已知氨基酸預(yù)活化溫度、時間和偶聯(lián)反應(yīng)溫度對于氨基酸偶聯(lián)的各種特征雜質(zhì)的形成具有潛在的關(guān)鍵性。在全因子DOE (full factorial design)設(shè)計中，三個研究參數(shù)的范圍，即耦合溫度、預(yù)活化溫度和預(yù)活化時間，指定為[10°C，30°C]，[10°C，30 °C] 和 [1 分鐘，20 分鐘]?？偣矊嵤┝?11 次實驗，包括整個設(shè)計空間的三個中心點復(fù)制，以測試曲率并估計純誤差。設(shè)計的響應(yīng)包括 D-His(Trt) 和 DIC-封端 雜質(zhì)。11個DOE實驗結(jié)果在Table 1中顯示。Table 1. DIC/HOBt·H2O 的 Fmoc-His(Trt)-OH 耦合的 DOE實驗結(jié)果D-His 模型（Figure 1）顯示，預(yù)活化時間和預(yù)活化溫度在 Fmoc-His(Trt)-OH 消旋化中起最重要的作用。此外，預(yù)活化溫度和預(yù)活化時間之間的相互作用強烈影響 D-His 雜質(zhì)含量。其他重要因素，即耦合溫度以及耦合溫度和預(yù)活化時間之間的相互作用，影響相對較小。這些發(fā)現(xiàn)在機制上是合理的，因為氨基酸的外消旋化主要發(fā)生在其羧酸鹽被活化時。氨基酸被預(yù)活化的程度越強，例如在高溫下和預(yù)活化時間延長，其外消旋作用就越大。Figure 1. D-His 雜質(zhì)與預(yù)活化溫度/預(yù)活化時間的 3D 表面圖（耦合溫度恒定為 20 °C）。鑒于預(yù)活化時間的突出關(guān)鍵性，需要將此參數(shù)控制在低水平，以確保 D-His 雜質(zhì)低于目標(biāo)含量 2.0%。一旦預(yù)活化時間為一分鐘，預(yù)測的 D-His 雜質(zhì)含量將在設(shè)計空間內(nèi)一致小于 2.0%。如果預(yù)活化溫度和偶聯(lián)溫度都設(shè)置在低水平，它甚至可以降低到 1.0% 以下。如果將預(yù)活化時間延長至十分鐘，則組氨酸外消旋化保持在2.0%以下的概率將大大降低，而當(dāng)預(yù)活化超過二十分鐘時，這一目標(biāo)幾乎無法實現(xiàn)（Figure 2）。Figure 2. D-His 雜質(zhì)與耦合溫度/預(yù)活化溫度的 3D 表面和等高線圖，預(yù)活化時間為常數(shù)（從左到右分別為 1、10、20 分鐘）。DIC-封端模型表明，預(yù)活化時間是DIC 封端副反應(yīng)的最關(guān)鍵參數(shù)，其次是耦合溫度。與 D-His 模型相反，預(yù)活化溫度和預(yù)活化時間對 DIC 封端的主要影響為負(fù)，表明通過單獨增加預(yù)活化溫度或預(yù)活化時間 的方法，DIC-封端雜質(zhì)會減少（Figure 3）。Figure 3. DIC 封端雜質(zhì)與預(yù)活化溫度/預(yù)活化時間的 3D 表面圖（耦合溫度恒定為 20 °C）。Fmoc-His(Trt)-OH在偶聯(lián)反應(yīng)過程中高度傾向于消旋化。本研究中的 D-His 肽雜質(zhì)對純化過程提出了明顯的挑戰(zhàn)。通過DIC/HOBt·H2O/DMF耦合方法三因子兩水平全因子DOE設(shè)計，對 Fmoc-His(Trt)-OH 偶聯(lián)進行了優(yōu)化，以將外消旋化降低到 2.0%。所有三個研究的參數(shù)，即耦合溫度、預(yù)活化溫度和預(yù)活化時間，在D-His以及DIC-封端的兩個模型中都很重要，并且預(yù)活化時間在這兩種情況下都是最顯著的因素。雙因素相互作用（耦合溫度*預(yù)活化時間）和（預(yù)活化溫度*預(yù)活化時間）對 D-His 模型是顯著的，而（耦合溫度*預(yù)活化溫度）對于 DIC 封端模型是顯著的。預(yù)活化時間/預(yù)活化溫度與 D-His/DIC 封端之間的相關(guān)性是相反的。更長的預(yù)活化時間和預(yù)活化溫度將減弱 DIC 封端，但會加劇組氨酸外消旋化。
鑒于在本研究中 D-His 抑制比 DIC 封端具有更高的優(yōu)先級，因此設(shè)置了有利于 D-His 最小化的工藝參數(shù)。輪廓圖疊加方法被操縱以針對能夠同時滿足 D-His (≤2.0%) 和 DIC 封端 (≤0.2%) 目標(biāo)的參數(shù)設(shè)置。
具體來說，本研究最突出的發(fā)現(xiàn)總結(jié)如下：
? 組氨酸消旋取決于偶聯(lián)劑/添加劑和活化策略。
? 高溫和長時間的強化預(yù)活化會加劇組氨酸外消旋化。
? DIC 封端伴隨氨基酸偶聯(lián)過程中的氨基酸外消旋。
? 通過提高預(yù)活化溫度和延長預(yù)活化時間進行充分的氨基活化可以減少 DIC 封端和其他相關(guān)副反應(yīng)。
文獻(xiàn)詳情：
Yi Yang*, Lena Hansen, Alberto Baldi. Suppression of Simultaneous Fmoc-His(Trt)-OH Racemization and Nα-DIC-Endcapping in Solid-Phase Peptide Synthesis through Design of Experiments and Its Implication for an Amino Acid Activation Strategy in Peptide Synthesis. Organic Process Research & Development. 2022. https://doi.org/10.1021/acs.oprd.2c00144
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