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基于光誘導電子轉(zhuǎn)移(PeT)原理的傳感器通常是依賴于PeT進入激發(fā)態(tài)(受體PeT)或脫離激發(fā)態(tài)(供體PeT)進行信號傳輸?shù)摹＝?，加州大學伯克利分校的Evan W. Miller教授課題組通過引入吸電子分子導線來反轉(zhuǎn)電子流動的方向，首次開發(fā)了供體PeT (d-PeT) 型電壓敏感熒光染料(VF)。在該設計中，含有吸電子基團的VF染料具有電壓敏感熒光特性，但是和受體PET (a-PET) 型電壓敏感熒光染料的極性是相反的，在超極化生物膜電位狀態(tài)下會增強熒光。相關(guān)成果以“Flipping the Switch: Reverse-Demand Voltage-Sensitive Fluorophores”為題發(fā)表于J. Am. Chem. Soc. (DOI: 10.1021/jacs.2c05385)。

生物膜電位(V_m)源于選擇性滲透脂質(zhì)雙層中離子濃度的差異，是生命的決定性特征。使用熒光指示劑可視化細胞V_m為傳統(tǒng)電極方法提供了強大的補充，并力求解決與電生理學相關(guān)的低通量、空間分辨率差和侵入性問題。熒光染料長期以來一直用于監(jiān)測生物學相關(guān)的分析物、反應和性質(zhì)。光誘導電子轉(zhuǎn)移(PeT)的調(diào)控是設計熒光報告分子的有效方法，是通過基于與分析物（如離子和反應性代謝物）的結(jié)合或反應控制PeT進入或退出熒光團的激發(fā)態(tài)。

作者在前期研究中一直在探索基于PeT的傳感器來監(jiān)控V_m。他們假設電壓敏感熒光團內(nèi)的電壓敏感性來自于對V_m敏感的電子轉(zhuǎn)移，因此電子轉(zhuǎn)移的方向很重要。在超極化V_m下，當電子從質(zhì)膜中的分子導線移動到細胞外表面的熒光團中時，會發(fā)生PeT，染料的發(fā)光得到淬滅；而在去極化的V_m下，電壓降低了PeT的速率，染料的熒光得到增強。與這一假設一致，電壓敏感熒光染料(VF)在膜去極化時具有熒光開啟響應、納秒響應動力學和電壓依賴性熒光壽命。當前，所有VF染料都是使用含苯胺的分子導線在受體PeT (a-PeT) 結(jié)構(gòu)中實現(xiàn)電壓敏感性，其中熒光團充當電子受體。然而，如果關(guān)于電壓傳感機制的假設是正確的，用吸電子基團(EWG)代替富電子苯胺應該會降低導線的前沿分子軌道能量并實現(xiàn)供體激發(fā)的PeT (d-PeT)。在這種結(jié)構(gòu)中，超極化的V_m會降低PeT的速率，因而導致超極化電位下的熒光增亮（圖1）?；诖?，作者計算了一系列含有EWG取代基的分子導線的HOMO/LUMO能量，合成了5種新的EWG-VF染料，表征了它們的光譜特性，并評估了它們在哺乳動物細胞中的電壓敏感性。其中，兩種新染料顯示出電壓敏感性，但相對于先前報道的含苯胺的VF染料極性相反（圖2）。

圖 1. 電壓敏感熒光團中的PeT過程（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖 2. 含EWG的VF染料的合成（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

首先，為了研究通過d-PeT反轉(zhuǎn)VF染料極性的可能性，作者進行了密度泛函理論(DFT)計算以預測正交熒光團和分子導線體系中的相對HOMO/LUMO能量 （圖3）。對于像4-NO₂-VF這樣的EWG-VF染料，作者發(fā)現(xiàn)4-NO₂-VF的導線LUMO比熒光素LUMO低-0.58 eV，表明可能存在d-PeT。同時，作者計算了包含其他EWG的分子導線的軌道能量。其中，4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF都具有大約-0.6 eV或更大的LUMO?LUMO (L?L) 間隙?；诖耍髡哒J為用4-NO₂和2,4-diNO₂等強EWG取代可能會生成d-PeT VF染料。

圖 3. 密度泛函理論(DFT)計算（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

為了驗證VF染料可以“反向運行”的假設，作者合成了5種不同的EWG取代的二苯乙烯衍生物。由于具有相同的熒光團，所有EWG-VF染料的最大吸收均位于511 nm處，最大熒光發(fā)射位于527 nm （圖4），而染料的熒光量子產(chǎn)率范圍為0.09-0.71。其中，4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF都具有低熒光量子產(chǎn)率，表明了高度的PeT淬滅效應。而且，在高濃度硫醇（2 mM谷胱甘肽）的存在情況下，EWG-VFs表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性。

圖 4. VF染料的光譜性質(zhì)（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接著，實驗表明所有EWG-VF染料都可染色HEK293T細胞的質(zhì)膜（圖5），4-NO₂-VF的膜染色最亮。然后，作者使用全細胞膜片鉗電生理學評估了HEK293T細胞中新型EWG-VF染料的電壓敏感性（圖6）。結(jié)果顯示，具有4-NO₂取代基的EWG-VF染料表現(xiàn)出電壓敏感性，但極性相反，4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF 的熒光在去極化時降低，在超極化時變得更亮。但是，2,4-diNO₂-VF在細胞中顯示出非常弱的熒光，比4-NO₂-VF低約40倍，因此作者利用4-NO₂-VF進一步監(jiān)測了大鼠海馬神經(jīng)元中的誘發(fā)動作電位(AP)。在單次試驗中，4-NO₂-VF報告的AP平均ΔF/F為-1.3%±0.14，信噪比(SNR)為9.1±1.0。對神經(jīng)元AP去極化的反應是熒光降低，表明d-PeT指示劑能夠在復雜的細胞環(huán)境中起作用。

圖 5. 細胞成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖 6. 含EWG的VF染料在活細胞中的電壓敏感性（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

接著，在比-100 mV更負的超極化電位下，4-NO₂-VF變得更亮，實現(xiàn)了+2.4%的超極化開啟響應。在極端超極化電位下，光學響應偏離-100和+100 mV之間觀察到的線性。超極化電位在抑制性神經(jīng)傳遞中發(fā)揮重要作用，更廣泛地說，在線粒體的生理學中發(fā)揮重要作用，其中靜息線粒體電位在-100 -200 mV的范圍內(nèi)。最后，作者證明了4-NO₂-VF可用于V_m動態(tài)的雙色映射，表明d-PeT方法能夠提供快速響應動力學并且與雙色成像兼容（圖 7）。

圖 7. 4-NO₂-VF在超極化電位下的電壓敏感性（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

加州大學伯克利分校的Evan W. Miller教授課題組報道了基于d-PeT的電壓敏感熒光染料的設計、合成和驗證。在該工作中，作者合成了5種不同的吸電子基團取代的熒光染料，表征了它們的光譜特性，并評估了它們在哺乳動物細胞中的電壓敏感性。其中4-NO₂-VF和2,4-diNO₂-VF都是電壓敏感的，可作為超極化的開啟指示器。而且，4-NO₂-VF被成功應用于活細胞中，在超極化生物膜電位狀態(tài)下顯示出增強的熒光信號。

文獻詳情：