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DNA在內(nèi)源性或外源性因素的持續(xù)攻擊下形成的異常結(jié)構(gòu)被稱為DNA損傷。人體中的DNA損傷與衰老、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等密切相關(guān)，繪制DNA損傷在基因組中的分布對(duì)于深入解讀其致病機(jī)制、研究DNA損傷修復(fù)耐受性、開發(fā)癌癥診療策略、評(píng)估抗腫瘤藥物療效等方面均有著深遠(yuǎn)意義。然而，目前測(cè)序DNA損傷的工具十分匱乏，由于DNA損傷的致突變以及復(fù)制阻滯特性，其信息難以通過二代測(cè)序技術(shù)讀取。面對(duì)類型多樣的DNA損傷，目前僅有極少數(shù)的DNA損傷借助二代測(cè)序與抗體富集/化學(xué)標(biāo)記相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)了測(cè)序，且難以避免抗體或化學(xué)標(biāo)記策略特異性不足的問題，從原理上講，通過二代測(cè)序同時(shí)表征DNA中不同類型的DNA損傷也是極為困難的。因此，引入新的DNA損傷測(cè)序方法對(duì)于推動(dòng)DNA損傷相關(guān)的基礎(chǔ)研究以及相應(yīng)疾病診療方案的開發(fā)而言十分重要。

納米孔測(cè)序作為第三代單分子測(cè)序技術(shù)，具有直接測(cè)序核酸的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在直接表征廣泛的核酸序列修飾或損傷方面極具潛力。然而，常規(guī)的納米孔測(cè)序分析（圖1A, Detection mode I）會(huì)產(chǎn)生測(cè)序錯(cuò)誤，如對(duì)于目標(biāo)修飾堿基的分辨率不足或檢測(cè)受序列環(huán)境干擾而產(chǎn)生錯(cuò)讀，以及目標(biāo)堿基過孔速度太快而造成漏檢。

近日，南京大學(xué)黃碩教授課題組在Nano letters上報(bào)道了一種新型通過在納米孔測(cè)序中監(jiān)測(cè)聚合酶阻滯動(dòng)力學(xué)的DNA損傷測(cè)序方法（圖1 A, Detection mode II），利用單分子水平上DNA損傷與聚合酶活性位點(diǎn)間相互作用匯報(bào)出的酶阻滯動(dòng)力學(xué)特征，成功實(shí)現(xiàn)了三種烷基化試劑誘導(dǎo)形成的致突變性與致癌性DNA堿基損傷O⁶-羧甲基鳥苷（O⁶-carboxymethylguanosine，O⁶-CMG）、O⁶-甲基鳥苷（O⁶-methylguanosine，O⁶-MeG）與無堿基位點(diǎn)（abasic site, AP site）的準(zhǔn)確區(qū)分（圖1B）。并且，該方法也為常規(guī)納米孔測(cè)序中出現(xiàn)的測(cè)序錯(cuò)誤提供了解決方案。

圖1. 通過在納米孔測(cè)序中監(jiān)測(cè)聚合酶阻滯動(dòng)力學(xué)區(qū)分DNA損傷的概念演示。 

DNA損傷在納米孔測(cè)序中產(chǎn)生了具有高度一致性的聚合酶阻滯信號(hào)，表現(xiàn)為兩個(gè)重復(fù)的電流平臺(tái)之間的持續(xù)波動(dòng)（圖2A）。從測(cè)序事件中繪制出酶沿DNA模板位置移動(dòng)的軌跡，揭示了聚合酶在DNA損傷位點(diǎn)發(fā)生了阻滯（圖2B）。聚合酶阻滯顯著延長(zhǎng)了DNA損傷通過孔道的總體時(shí)間，有助于規(guī)避在納米孔測(cè)序中因目標(biāo)堿基損傷太快通過孔道而產(chǎn)生漏檢的測(cè)序錯(cuò)誤。酶阻滯動(dòng)力學(xué)特征分析結(jié)果顯示，單分子聚合酶阻滯動(dòng)力學(xué)能為DNA堿基損傷提供可靠的、不易受序列環(huán)境干擾的檢測(cè)指標(biāo)（圖2C-D），不同于受目標(biāo)修飾堿基周圍序列影響而產(chǎn)生測(cè)序錯(cuò)誤的常規(guī)納米孔測(cè)序讀取，酶動(dòng)力學(xué)特征可能有助于檢測(cè)未知序列環(huán)境中的DNA損傷或修飾。O⁶-CMG、O⁶-MeG和AP site三種DNA損傷能夠通過各自的單分子酶阻滯動(dòng)力學(xué)特征實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確區(qū)分（圖2E），而標(biāo)準(zhǔn)納米孔測(cè)序會(huì)造成O⁶-MeG的誤讀，且難以區(qū)分O⁶-CMG和AP site（圖3），充分驗(yàn)證了酶阻滯動(dòng)力學(xué)策略用于DNA損傷檢測(cè)的可行性及檢測(cè)能力。

圖2. 利用單分子聚合酶阻滯動(dòng)力學(xué)鑒定DNA損傷。  

圖3. 利用常規(guī)納米孔測(cè)序分析鑒定DNA損傷。 

該工作以“Discrimination between Different DNA Lesions by Monitoring Single-Molecule Polymerase Stalling Kinetics during Nanopore Sequencing”為題，于2022年6月17日發(fā)表于《Nano letters》（文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.nanolett.2c01833，DOI: 10.1021/acs.nanolett. 2c01833）。南京大學(xué)博士生張金月與碩士生王宇為論文的共同第一作者，南京大學(xué)黃碩教授為論文的通訊作者，陳洪淵院士對(duì)該工作做出了重要指導(dǎo)。此項(xiàng)研究得到了生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院（ChemBIC）的重要支持，與國(guó)家自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：31972917，91753108，21675083）、中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)資助（項(xiàng)目編號(hào)：020514380257，020514380261）、江蘇省高層次創(chuàng)業(yè)創(chuàng)新人才引進(jìn)計(jì)劃（個(gè)人、團(tuán)體計(jì)劃）、江蘇省自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：BK20200009）、南京大學(xué)卓越計(jì)劃（項(xiàng)目編號(hào)：ZYJH004）、上海市市級(jí)科技重大專項(xiàng)、南京大學(xué)生命科學(xué)分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（項(xiàng)目編號(hào)：5431ZZXM1902）、南京大學(xué)科技創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目、中國(guó)博士后科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：2021M691508）等經(jīng)費(fèi)支持。

參考資料：https://chem.nju.edu.cn/df/29/c12639a581417/page.htm