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光異構(gòu)化反應(yīng)由于其靈敏的感光生物學(xué)功能，被廣泛的應(yīng)用于化工領(lǐng)域，如光學(xué)數(shù)據(jù)儲(chǔ)存、分子轉(zhuǎn)換。光異構(gòu)反應(yīng)中，以雙鍵順反異構(gòu)化最為常見。共軛體系如綠色熒光蛋白(GFP)雙鍵的異構(gòu)化有兩種途徑，單鍵翻轉(zhuǎn)（OBF）和鍵角扭轉(zhuǎn)（HT）（Figure 1）。OBF途徑只有τ鍵旋轉(zhuǎn)，而HT途徑相鄰的φ鍵隨著τ鍵旋轉(zhuǎn)，OBF途徑的原子軌道所需要的體積比HT途徑大。因此，OBF途徑常發(fā)生在允許自由運(yùn)動(dòng)的環(huán)境中，而HT途徑常發(fā)生在空間受限的環(huán)境中。

為了探尋綠色熒光蛋白(GFP)雙鍵光學(xué)異構(gòu)化的途徑，作者以rsEGFP2（可逆轉(zhuǎn)換增強(qiáng)綠色熒光蛋白2） 為模型進(jìn)行檢測。rsEGFP2具有易結(jié)晶的特點(diǎn)和良好的光學(xué)特性。β-桶狀折疊的rsEGFP2發(fā)光團(tuán)自然條件下呈現(xiàn)順式構(gòu)象，在488nm的激光照射下很容易異構(gòu)化為反式構(gòu)象，相反，在405nm的激光照射下，反式構(gòu)象異構(gòu)化回順式構(gòu)象。rsEGFP2還有一個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)，rsEGFP2很容易被基團(tuán)取代用來區(qū)分OBF和HT途徑。在野生型細(xì)胞中，rsEGFP2通過兩種途徑產(chǎn)生相同的反式產(chǎn)物。但如果取代基破壞rsEGFP2酚環(huán)的對(duì)稱性，兩種途徑就會(huì)產(chǎn)生不同的產(chǎn)物。當(dāng)帶有取代基的cis rsEGFP2發(fā)生OBF途徑時(shí)，變?yōu)?/span>trans syn，發(fā)生HT途徑時(shí)，變?yōu)?/span>trans anti（Figure 2B）。通過琥珀抑制使3-氯酪氨酸替換67殘基處的酪氨酸，生成一個(gè)鄰位氯取代的酚氧色團(tuán)。此變體Cl-rsEGFP2與野生型rsEGFP2有類似的光敏特性(Table S1)。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

以發(fā)光團(tuán)cis狀態(tài)為準(zhǔn)，氯取代基處于anti的方向(Figure 3A)。當(dāng)發(fā)光團(tuán)異構(gòu)化為trans，氯取代基處于syn的方向，并且Cl-rsEGFP2的兩個(gè)環(huán)不再平行（τ = 12°, φ = ?13° in cis; τ = 187°, φ = ?32° in trans  τ 為N?C=C?C1二面角，φ 為 C=C?C1?C6二面角）（Figure 2B），另外，空間構(gòu)象輕微扭曲形成新的反式構(gòu)象，酚羥基不再與His149形成氫鍵，而與水分子形成氫鍵。His149與Tyr146形成氫鍵(Figure 3A)。

   作者統(tǒng)計(jì)比較了一些Cl-rsEGFP2的晶體數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)一些晶體的單位尺寸大小比之前報(bào)道的小7%，眾所周知，當(dāng)水進(jìn)入或離開單個(gè)蛋白質(zhì)之間的溶劑通道時(shí)，蛋白質(zhì)晶體會(huì)膨脹或收縮。實(shí)驗(yàn)操作的微小變化會(huì)導(dǎo)致Cl-rsEGFP2的溶劑含量變化。作者發(fā)現(xiàn)可通過將Cl-rsEGFP2晶體浸泡在相對(duì)濕度較低的低溫保護(hù)劑中，來控制降低Cl-rsEGFP2的晶格間距。低溫保護(hù)劑可將水從晶體中抽出，使之更緊密聚集在一起，從而得到“收縮”晶體。當(dāng)Cl-rsEGFP2收縮成更緊密的晶格時(shí)，其折疊方式不變，但尾部和環(huán)路區(qū)域出現(xiàn)了輕微偏差。蛋白質(zhì)在cis狀態(tài)下收縮晶體與膨脹晶體的內(nèi)部幾何構(gòu)型相同，trans狀態(tài)下收縮晶體與膨脹晶體相比空間結(jié)構(gòu)明顯扭曲。有趣的是，trans狀態(tài)下收縮晶體Cl-rsEGFP2的兩個(gè)環(huán)平行，且與與His149形成氫鍵(Figure 3B)。這種現(xiàn)象在多個(gè)晶體中都有發(fā)現(xiàn)。Cl-rsEGFP2的晶體結(jié)構(gòu)表明，晶格的微小重排可以改變光異構(gòu)化途徑。由于順反異構(gòu)化反應(yīng)對(duì)介質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)很敏感，膨脹晶體常以OBF途徑異構(gòu)，而收縮晶體則以HT途徑異構(gòu)。

(圖片來源：J. Am. Chem. Soc.)

Kao等人以Dronpa（可逆光致變色熒光蛋白）為研究對(duì)象，觀察到介質(zhì)粘度增加會(huì)減慢Dronpa的光敏速率，無論是溶劑粘度還是晶體填料都會(huì)影響發(fā)光團(tuán)異構(gòu)化，表明發(fā)光團(tuán)的異構(gòu)化與蛋白質(zhì)的β-桶狀折疊運(yùn)動(dòng)是耦合的。本文作者研究結(jié)論與其相似。Cl-rsEGFP2的結(jié)晶條件可能會(huì)干擾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并引起功能后果。眾所周知，蛋白質(zhì)的向外殘基和柔性環(huán)在晶體內(nèi)可能相互作用引起結(jié)構(gòu)改變，而蛋白質(zhì)內(nèi)部很少受到影響。而本文中，trans Cl-rsEGFP2的晶體結(jié)構(gòu)單位體積收縮7%時(shí)，出現(xiàn)了明顯的結(jié)構(gòu)改變，說明晶體填充的相互作用影響了trans Cl-rsEGFP2內(nèi)殘基的構(gòu)象。

小結(jié)：本文詳述了Cl-rsEGFP2晶體順反異構(gòu)化的機(jī)理。顯然，蛋白質(zhì)異構(gòu)化的途徑不是蛋白質(zhì)所固有的，而是取決于蛋白質(zhì)在晶體中的構(gòu)象。膨脹晶體常以OBF途徑異構(gòu)化；單位體積收縮7%的收縮晶體常以HT途徑異構(gòu)化。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)光團(tuán)的異構(gòu)化與蛋白質(zhì)的β-桶狀折疊運(yùn)動(dòng)是耦合的。在不同的熒光蛋白中，異構(gòu)化的機(jī)制可能不一樣。研究結(jié)果表明結(jié)晶條件可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)面向內(nèi)的殘基結(jié)構(gòu)重排。