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羅丹明衍生物和類似物已廣泛用于不同的超分辨率成像技術，尤其是光活化定位顯微技術（PALM）。這些羅丹明衍生物和類似物中，羅丹明螺內酰胺因為在光變色轉換過程中具有理想的光暗對比度，所以在PALM成像方面表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。雖然研究者早就開始對羅丹明螺環(huán)內酰胺進行修飾，但是幾乎沒有人考慮到PALM成像的一個重要特征——光變色轉換工作時間。在PALM成像中，空間分辨率和時間分辨率之間總是不能同時滿足。

圖1. a)常見羅丹明螺環(huán)內酯的光致變色機理，如Rh-PHT和Rh-MGly；b) 鋅離子型羅丹明螺內酯的光致變色機理；c)肖義教授團隊光致變色機理，Rh-Gly（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

為了更好地理解酸度對螺環(huán)內酰胺或兩性離子存在的影響，作者測定了Rh-Gly和類似物Rh-MGly在相同條件下的pKa。結果表明，Rh-Gly轉化為相應的兩性離子不需要強酸性條件，并且兩性離子可以通過“自穩(wěn)定”結構在一定程度上得到穩(wěn)定。這種穩(wěn)定延長了兩性離子的壽命，有助于提高Rh-Gly的光激活效率。

 圖2. a) 羅丹明螺環(huán)內酰胺的自發(fā)環(huán)化平衡；b,c) Rh-Gly發(fā)射光譜和pH的關系（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

因為羅丹明螺環(huán)內酰胺在中性介質中不斷自發(fā)開環(huán)，Rh-Gly的弱酸性pKa保證了其大部分熒光團在生理條件下以非熒光螺環(huán)內酰胺的形式存在，從而避免了活細胞PALM成像過程中信號重疊。

作者還對Rh-Gly的光激活條件和單分子熒光工作時間進行了研究。與類似物Rh-MGly和早前報道的PALM染料Rh-Pht相比，Rh-Gly在單分子水平上延長工作時間表現(xiàn)出可重復性和紫外激活可控性。羧基對兩性離子的穩(wěn)定作用不僅增加了總光子的聚集，而且提高了單分子的亮度。

圖3. Rh-Gly的光活化、單分子熒光的實時測量及與類似物的比較（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

  緊接著，作者研究了Rh-Gly對活細胞線粒體的PALM成像情況。研究結果表明：Rh-Gly在不同的細胞系(HeLa和MCF-7)中也顯示出一種特殊的線粒體染色特性。由于工作時間的延長，Rh-Gly的活細胞線粒體PALM成像的瞬時分辨率被縮短到10秒的同時，還保留了大約25 nm的定位精度?？臻g分辨率和時間分辨率之間的平衡使得Rh-Gly可以用于獲得更多活細胞線粒體的高質量超分辨率圖像。此外延長的工作時間使得Rh-Gly具有獲得更寬廣的單分子運動軌跡的潛力。

圖4. Rh-Gly的雙色共域分析（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖5.在活體HeLa中線粒體富集區(qū)的超分辨率成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

作者還分別使用HaloTag配體衍生物和異硫氰酸酯衍生物（NCS）修飾Rh-Gly，使得Rh-Gly可以標記特殊細胞。通過自標記蛋白標簽，HaloTag配體修飾的Rh-Gly可以用于histone H₂B蛋白在活的HeLa細胞中的超分辨率成像；通過免疫染色抗體標記法，異硫氰酸酯（NCS）修飾的Rh-Gly可以在被固定的細胞中實現(xiàn)微管的超分辨率成像。

圖6. 組蛋白的超分辨率成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

圖7. 微管超分辨率成像（圖片來源：J. Am. Chem. Soc.）

總結：不同于以往利用羅丹明染料的螺環(huán)對pH，RNS/ROS等響應，大連理工大學肖義教授團隊設計了一種新的羅丹明螺環(huán)內酰胺染料Rh-Gly解決PALM成像中工作時間問題，發(fā)展了一種簡單而有效的延長光致變色羅丹明螺內酰胺工作時間的策略，有利于PALM成像。通過在靠近內酰胺的位置引入一個羧基，發(fā)揮內酸性作用，穩(wěn)定了光產(chǎn)生的兩性離子。Rh-Gly在單分子水平上表現(xiàn)出可重復和紫外可控的激活能力，延長了兩性離子的時間。羧基對兩性離子的穩(wěn)定作用不僅增加了總光子的收集量，而且提高了單分子的亮度。此外，Rh-Gly在不同的細胞系(HeLa和MCF-7)中也有特異性的線粒體染色。隨著時間的延長，活細胞線粒體PALM成像的時間分辨率縮短到10 s，定位精度保持在25 nm左右。由于時空分辨率的平衡，Rh-Gly進一步獲得了活細胞線粒體的一系列超分辨率圖像。HaloTag配體衍生物和異硫氰酸酯衍生物擴展了Rh-Gly對特定細胞標記的功能；通過自標記蛋白標記和免疫染色方法，這些衍生物能夠對HeLa細胞中的組蛋白和微管進行高分辨率成像。因此，肖義教授團隊的工作為今后羅丹明螺環(huán)內酰胺的開發(fā)提供了一條新的途徑。

撰稿人：犟子柳