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產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌（CPE）是一種革蘭氏陰性菌，它可通過位于細(xì)菌細(xì)胞間質(zhì)的碳青霉烯酶有效水解碳青霉烯類抗生素的C-N鍵（如亞胺培南，美羅培南，厄他培南等），繼而導(dǎo)致這些藥物失效，使臨床抗感染治療陷入無藥可用的危機(jī)。同時(shí)因?yàn)榇蠖鄶?shù)碳青霉烯酶基因位于質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等可轉(zhuǎn)移性基因元件上，可導(dǎo)致耐藥基因在不同菌種間快速傳播，誘發(fā)醫(yī)院內(nèi)感染或爆發(fā)流行。鑒于其高感染率、高致死率和高傳播性，CPE已成為當(dāng)今全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅之一。酶的活性受其細(xì)胞內(nèi)生理環(huán)境的精細(xì)調(diào)控，因此，評(píng)估天然細(xì)胞環(huán)境中碳青霉烯酶的酶促反應(yīng)對(duì)于獲得其準(zhǔn)確催化活性信息以及早期疾病檢測(cè)至關(guān)重要。

圖1.（a）實(shí)驗(yàn)流程示意圖。（b）用亞胺培南或緩沖液滴定活KPC-Kp懸液的反應(yīng)熱譜圖。 （c）用亞胺培南滴定陰性細(xì)菌懸液（ESBL-Kp和AmpC-Kp）和KPC蛋白的熱譜圖。（d）EDTA或舒巴坦對(duì)KPC-Kp水解亞胺培南熱譜曲線的影響。

由于任何酶促化學(xué)反應(yīng)都伴有一定的熱量吸收或釋放，并且熱量的變化速率和酶催化速率成正比，因而反應(yīng)量熱法可以為監(jiān)測(cè)天然底物與酶的反應(yīng)進(jìn)程提供一種普適、有力的研究工具。又因?yàn)榱繜岱ㄒ策m用于溶劑不透明或混濁的溶液，為復(fù)雜體系內(nèi)研究酶活提供了可能。如圖1所示，作者通過比較產(chǎn)KPC 酶肺炎克雷伯菌懸液（KPC-Kp）與純化的KPC 酶溶液（A類碳青霉烯酶）水解亞胺培南過程中的熱譜曲線證實(shí)了細(xì)胞量熱法（in cell-calorimetry）的可行性。進(jìn)一步，作者觀察到用KPC-Kp所得到的熱量變化可以被A類碳青霉烯酶抑制劑舒巴坦完全抑制，而B類碳青霉烯酶抑制劑EDTA對(duì)其沒有影響，證實(shí)熱變化曲線可以特異性地反映亞胺培南在活細(xì)菌中被水解的過程。

圖2. OXA-48型碳青霉烯酶催化亞胺培南（IMI）具有“雙相動(dòng)力學(xué)”特征。補(bǔ)充CO₂對(duì)（a）量熱法中OXA-48-Kp懸液和（b）紫外光譜法中OXA-48-Kp裂解上清液水解亞胺培南的催化活性的影響。

隨后作者揭示了OXA-48型碳青霉烯酶的熱譜曲線具有特異的“雙相動(dòng)力學(xué)”特征（圖2）。該特征隨NaHCO₃濃度的提高而消失，證實(shí)OXA-48酶在催化過程中其活性中心的賴氨酸會(huì)發(fā)生去羧基化，進(jìn)一步導(dǎo)致酶在催化過程中失活，該特征可以作為特征“指紋”圖譜用于攜帶OXA-48細(xì)菌的特異性檢測(cè)。同時(shí)作者對(duì)比了量熱法和紫外分光光度法檢測(cè)OXA-48型碳青霉烯酶水解活性的譜圖，發(fā)現(xiàn)量熱法可以更靈敏地揭示催化過程中反應(yīng)速率的變化，因此在研究這種特殊的反應(yīng)機(jī)理方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

圖3.比較了分別使用（a）量熱法和（b）Carba-NP法檢測(cè)產(chǎn)KPC碳青霉烯酶活細(xì)菌的靈敏度。

接著，作者對(duì)量熱法檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶細(xì)菌的靈敏度做了測(cè)試，并將其與臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的Carba NP方法進(jìn)行了比較（圖3）。結(jié)果表明細(xì)胞量熱法可以準(zhǔn)確檢測(cè)所有臨床常見的碳青霉烯酶，檢測(cè)下限為3-19 nM碳青霉烯酶（10⁶-10⁸ 細(xì)菌）。該結(jié)果比Carba NP方法檢測(cè)靈敏度至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖4. 細(xì)胞量熱法檢測(cè)142株臨床細(xì)菌的結(jié)果及其與其它方法的對(duì)比。碳青霉烯酶陽性樣品標(biāo)記為“+”，碳青霉烯酶陰性樣品標(biāo)記為“ - ”。紅色虛線表示細(xì)胞量熱法的檢測(cè)閾值。

作者最后對(duì)細(xì)胞量熱法在CPE快速檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了驗(yàn)證（圖4）。實(shí)驗(yàn)采用了來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院分離的142株臨床細(xì)菌作為樣品，分別采用細(xì)胞量熱法、Carba NP方法、mCIM法、MHT法和MIC法進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)胞量熱法具有最佳檢測(cè)靈敏度（97％）和特異性（100％），在檢測(cè)時(shí)間方面也具有明顯優(yōu)勢(shì)（10分鐘內(nèi)），有望應(yīng)用于臨床耐藥細(xì)菌的快速檢測(cè)。

總結(jié)：本文報(bào)道了一種基于碳青霉烯酶催化底物過程中的“熱信號(hào)”變化來特異性、實(shí)時(shí)、原位跟蹤細(xì)胞內(nèi)酶活的實(shí)驗(yàn)方法，并證明了該技術(shù)在新型催化機(jī)理和快速鑒定臨床CPE方面的應(yīng)用。由于細(xì)胞量熱法概念簡(jiǎn)單，易于應(yīng)用于復(fù)雜生物體系（例如，腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞和囊泡等），因而具有廣泛應(yīng)用前景。

通訊作者介紹

和媛，女，化學(xué)博士，西北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院副教授，碩士研究生導(dǎo)師，第八批“陜西省百人”。 2011年獲得英國(guó)約克大學(xué) (the University of York) 博士學(xué)位，2011-2013年分別在加拿大Simon Fraser University（David Vocadlo 教授實(shí)驗(yàn)室）和美國(guó)斯克利普斯研究所 (The Scripps Research Institute; Jim Paulson 教授實(shí)驗(yàn)室) 進(jìn)行博士后研究，2013年加入西北大學(xué)。和媛副教授課題組主要從事疾病相關(guān)靶酶反應(yīng)機(jī)理及活性調(diào)控研究，主要研究手段包括：X-射線晶體衍射、酶學(xué)、等溫滴定微量熱（ITC）等。研究成果發(fā)表在包括Angewandte Chemie, JACS, Nature Structural & Molecular Biology, Nature Chemical Biology 等在內(nèi)的著名國(guó)際期刊?，F(xiàn)主持國(guó)家自然科學(xué)基金和陜西省擇優(yōu)資助項(xiàng)目。

徐紀(jì)茹，女，醫(yī)學(xué)博士，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教授、博士研究生導(dǎo)師，陜西省“三秦人才”。1982年獲西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)學(xué)士學(xué)位，1990年獲西安醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)碩士學(xué)位，2001年獲得英國(guó)貝爾法斯特Ulster大學(xué)博士學(xué)位，2004年聘為西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教授。主要研究方向：1. 正常菌群與宿主的依存關(guān)系；2. 感染性疾病的分子診斷；3. 細(xì)菌耐藥基因研究。共發(fā)表論文100余篇，培養(yǎng)博士和碩士研究生30余名。主要社會(huì)任職：1. 中國(guó)微生物學(xué)會(huì)真菌專業(yè)委員會(huì)委員；2.中國(guó)微生物學(xué)會(huì)微免專業(yè)委員會(huì)委員；3. 陜西省微生物學(xué)會(huì)副理事長(zhǎng)；4. 陜西省醫(yī)學(xué)會(huì)微生物學(xué)與免疫學(xué)分會(huì)副主任委員。